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士鋒生物DNA分子轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)技巧
最近更新時(shí)間：2013-10-13
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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實(shí)驗(yàn)原理：
體外通過基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒,選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù),可獲得含重組的陽性克隆.在此陽性克隆中,DNA可在生物體系中大量擴(kuò)增,繁殖,保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物,這是PCR體外擴(kuò)增DNA所不能替代的.配合DNA重組技術(shù),所獲得的,不同目的需要的陽性菌株已廣泛應(yīng)用于科研,醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域.
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān), 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)105-107轉(zhuǎn)化子/μg DNA.獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備.感受態(tài)就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài),只有發(fā)展為感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定攝取外來的DNA分子. pUC18的LacZ基因區(qū)域當(dāng)有dna段插入時(shí),LacZ基因失活,轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養(yǎng)基生長時(shí),會(huì)產(chǎn)生白色的克隆,不含插入片段的pUC18質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞生成藍(lán)色菌落.
DNA分子轉(zhuǎn)化分以下幾步：
1、 吸附--雙鏈DNA分子吸附于受體菌表面;
2、 轉(zhuǎn)入--雙鏈DNA分子解鏈.一條鏈進(jìn)入受體菌,另一條降解;
3、 自穩(wěn)--外源質(zhì)粒dna分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈;
4、 表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制,分裂, 轉(zhuǎn)錄翻譯.
實(shí)驗(yàn)試劑：
LB培養(yǎng)基
質(zhì)粒DNA（含Amp抗生基因）,受體菌
CaCl2 0.1M
Amp
實(shí)驗(yàn)過程：
1、感受態(tài)細(xì)胞制備及CaCl2處理：
1） 將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,37℃培養(yǎng)16～20小時(shí).
2） 挑取單菌落轉(zhuǎn)入20mL LB培養(yǎng)基錐瓶中,37℃振蕩過.
3） 從中取2mL菌液轉(zhuǎn)入50mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)4-5小時(shí),測OD100達(dá)0.4～0.5.
4） 培養(yǎng)物于冰上10分鐘.
5） 轉(zhuǎn)入-50mL離心管,于4000rpm下4℃離心10分鐘.
6） 棄上清,倒置離心管1分鐘,流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分鐘.
7） 4,000rpm 4℃離心10分鐘,棄上清.
8） 加入2ml,0.1M CaCl2懸浮細(xì)胞,于4℃過.