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士鋒生物轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)步驟
最近更新時(shí)間:2013-10-16
提 供 商:上海士鋒生物科技有限公司資料大小:13.6KB
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士鋒生物轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)步驟,通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核,此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系,可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30分鐘-1.5小時(shí)),又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí))。
方法如下:
1. 接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5×105CO2 /孔/皿生長(zhǎng)2~3天,當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。
2. 乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒dna,空氣干燥后溶于40μL的TE中,或取供體DNA。
3. 用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長(zhǎng)因子血清的DMEM洗板(皿)。
4. 在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA,取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細(xì)胞中,使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色,培養(yǎng)4小時(shí)。
5. 從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖,加入5mL 10%DMSD,室溫放置1分鐘,吸出DMSO,用5mL 1×PBS洗一次吸出,加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。
6. 培養(yǎng)細(xì)胞,在適當(dāng)時(shí)間分析細(xì)胞,若含有抗藥基因,可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)。