會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://true-witness.com/st236594/
士鋒生物凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量
最近更新時(shí)間：2013-11-5
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：109次
資料類型：瀏覽次數(shù)：630次
實(shí)驗(yàn)步驟
1．凝膠溶脹
凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過(guò)量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過(guò)程中注意不要過(guò)分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，zui后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。
2. 裝柱與平衡
裝柱前須將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開(kāi)柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。裝柱要求連續(xù)、均勻、無(wú)氣泡、無(wú)“紋路”。
將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過(guò)2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來(lái)在加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。
3. 上樣與洗脫
樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開(kāi)柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開(kāi)出口并開(kāi)始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量（約1ml）洗脫液沖洗管壁2次。zui后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3～5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒流泵，調(diào)好流速，以每管3ml/10min流速開(kāi)始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%；制備用量為柱床容積的20%~30%。
4. 收集與鑒定
用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測(cè)儀280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，zui高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5．凝膠柱的處理
凝膠用過(guò)后，反復(fù)用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長(zhǎng)期用干燥狀態(tài)保存。
計(jì)算
分子量的測(cè)定和計(jì)算，一般都采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。只要測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的Ve，并以它們的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（logMr）對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對(duì)分子質(zhì)量。
注意事項(xiàng)
各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶?jī)?nèi)的排氣管應(yīng)無(wú)液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過(guò)程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。
始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。