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原核表達秘笈：切記重視表達前分析的重要性
最近更新時間：2013-11-6
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：37KB
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生物通原核表達技術(shù)專輯：表達不同于其它一些實驗，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達呢，你把質(zhì)粒克隆好啦，交給細胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達在表達當中來說還是比較簡單，細菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當然，它也存在一些缺乏修飾、細胞內(nèi)部還原性過高等缺點。
原核表達從一開始的設(shè)計就非常重要，所謂好的開始是成功的一半。做足準備功夫，可是省去很多將來后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時嘗試多種表達系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。
前面已經(jīng)介紹過許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達這個蛋白表達量奇高，但是另外一個就是做不出來，所以沒有的載體，只有永恒的分析。當然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達出來那是的，選擇同樣的載體表達成功率會高很多。如果沒有也嘗試找一些曾經(jīng)表達過和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達。
在下面將列出幾個影響表達的因素，大家可以在表達前根據(jù)這幾個因素自己分析一下：
翻譯起始位點
現(xiàn)在大部分的表達載體都提供起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點的距離進行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子
GC含量
表達序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進行預(yù)測。
二級結(jié)構(gòu)
在起始密碼子附近的mRNA二級結(jié)構(gòu)可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不*的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長度超過8個堿基，這種結(jié)構(gòu)會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。
基因或者蛋白的大小
一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達，在每個表達單位（即單體蛋白）間設(shè)計蛋白水解或者是化學斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。
對于另一個，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽，如6×組氨酸標簽。對于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達。當然表達時要根據(jù)目的進行截取，如果是要進行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認識到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結(jié)論，如果蛋白和免疫動物親緣關(guān)系較遠的話還是不妨一試的。
親疏水性
這也是一種經(jīng)驗之談，相信經(jīng)常做表達的人都發(fā)現(xiàn)表達親水區(qū)域時表達量會比較高，如果你要表達一個膜蛋白，那么勸你做好長期抗戰(zhàn)的準備吧。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進行分析。
對于自己表達的蛋白有所了解后就可以開始對載體進行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個元件：