會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://true-witness.com/st236594/
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)技術(shù):形態(tài)學(xué)檢查法
最近更新時(shí)間：2013-11-18
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：99次
資料類型：瀏覽次數(shù)：549次
（一）材料與試劑
1．小牛血清 取新生的小牛，無(wú)菌采血，分離血清。于56℃滅活后分裝小瓶，放入低溫冰箱保存。
2．雙抗 配成每毫升含青霉素1.00×104U，鏈霉素1.00×104U的混合液。存放于-20℃。
3．6%NaHCO3水溶液
4．肝素 以滅菌生理鹽水配成500U/ml，115℃滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆谩?
5．PHA 以滅菌生理鹽水配成1 000µg/ml，經(jīng)G-5漏斗過(guò)濾，分裝小瓶，保存于-20℃?zhèn)溆谩?
6．姬姆薩染液、瑞氏染液。
7．pH6.4磷酸鹽緩沖液：
KH2PO4 6.62g
Na2HPO4 2.56g
H2O 1 000.00ml
8．營(yíng)養(yǎng)液 采用199營(yíng)養(yǎng)液或RPMI－1640營(yíng)養(yǎng)液，配法如下：
199營(yíng)養(yǎng)液 79.00ml
小牛血清 20.00ml
“雙抗” 1.00ml
依次加入后，再用高壓滅菌的6% NaHCO3液調(diào)pH至7.2～7.3，分裝小瓶，每 瓶0.2ml。
（二）操作方法
1． 于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.2ml馬血，對(duì)照組與試驗(yàn)組各做2瓶，試驗(yàn)組均加PHA 30µg；
2．37℃培養(yǎng)72h，每天輕搖1~2次；
3．取出培養(yǎng)瓶，搖散血塊，倒入離心管，3 000r/min離心10min，去上清液；
4．用血球泥制備推片，晾干；
5．以瑞氏染液染2min~3min，加等量緩沖液，混勻繼續(xù)染3min，蒸餾水沖洗后再用姬姆薩染液染2min~3min。加等量緩沖染液感作7min~8min，餾水沖洗，晾干；
6．鏡檢，觀察，計(jì)數(shù)。
（三）結(jié)果判定
在油鏡下，觀察淋巴細(xì)胞的形態(tài)變化（見(jiàn)表21-1），以頭、體、尾三部分計(jì)算，至少計(jì)數(shù)100個(gè)或200個(gè)淋巴細(xì)胞，然后按公式計(jì)算出淋巴細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化率。
成年馬的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，根據(jù)原獸醫(yī)大學(xué)20例檢查，平均為35.58%。
不加PHA的對(duì)照組一般不轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化率只在1%左右。
表21-1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化前后形態(tài)學(xué)特點(diǎn)
轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征：①體積增大，約大于原成熟的淋巴細(xì)胞的2~3倍；②細(xì)胞核膜清晰,核內(nèi)染色質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)1~3個(gè)核仁,有的核呈分裂相；③胞漿豐富，有嗜堿性染色，核周圍的胞漿有一些淡染的透明帶，細(xì)胞呈偽足狀突起。
（四）注意事項(xiàng)
1．培養(yǎng)液zui適pH為7.2~7.4，過(guò)酸過(guò)堿都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)而降低轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)液的類型與動(dòng)物的白細(xì)胞有關(guān)，如小鼠的淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，用RPMI-1640，用199液則不成功。
2．培養(yǎng)時(shí)間 以72h~120h轉(zhuǎn)化率zui高，超過(guò)這個(gè)時(shí)間，則轉(zhuǎn)化率反而下降。
3．吞噬細(xì)胞有時(shí)在形態(tài)上易與“過(guò)渡型”混淆。但巨噬細(xì)胞有其固有的特點(diǎn)，核占細(xì)胞比較小且偏一邊，核染色質(zhì)濃集，細(xì)胞漿呈藍(lán)灰色或紅褐色，胞漿內(nèi)有大小不等的顆?；蛲淌晌铮液写笮〔坏鹊臍馀?。
4．涂片要少蘸些細(xì)胞，推出尾部來(lái)，因淋巴細(xì)胞較大，易集中在尾部及邊緣。
5．觀察淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，染色不要太濃，以便觀察核仁。
6．嚴(yán)格的無(wú)菌操作，是淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。