士鋒生物紅細(xì)胞免疫功能檢測(cè)技術(shù)

最近更新時(shí)間：2013-11-19

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一、原理 

人和多種動(dòng)物紅細(xì)胞與白細(xì)胞一樣，也具有重要的免疫功能。其基礎(chǔ)是紅細(xì)胞表面具有C3b受體（C3bR）。紅細(xì)胞可通過其表面的C3bR，發(fā)揮清除免疫復(fù)合物（IC）、促進(jìn)吞噬、提呈抗原及激活補(bǔ)體等多種作用。因此，建立的檢測(cè)紅細(xì)胞免疫功能的各種方法，也多以紅細(xì)胞表面的C3bR為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的?，F(xiàn)已建立的主要有紅細(xì)胞C3bR花環(huán)及IC花環(huán)試驗(yàn)、紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn)、單克隆抗體Coombs試驗(yàn)、抗C3bR單克隆抗體法、ELISA、放射配體結(jié)合法、紅細(xì)胞促吞噬作用測(cè)定法等。 
本實(shí)驗(yàn)以紅細(xì)胞C3bR花環(huán)及IC花環(huán)試驗(yàn)和紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn)為例，介紹紅細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)方法。C3bR酵母花環(huán)試驗(yàn)用于檢測(cè)紅細(xì)胞C3bR，原理為用小鼠等血清（補(bǔ)體）致敏后的酵母菌，使菌體表面吸附C3b，可與紅細(xì)胞表面的C3bR結(jié)合，從而將酵母細(xì)胞吸附在紅細(xì)胞周圍形成花環(huán)。紅細(xì)胞IC酵母花環(huán)試驗(yàn)用于檢測(cè)紅細(xì)胞表面的IC，原理為紅細(xì)胞表面的C3bR可與體內(nèi)形成的抗原—抗體—補(bǔ)體復(fù)合物種的補(bǔ)體成分結(jié)合，而將免疫復(fù)合物吸附在其表面，而酵母細(xì)胞也可與免疫復(fù)合物中的補(bǔ)體成分結(jié)合，從而被吸附于細(xì)胞表面形成花環(huán)。而紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn)的原理為，葡萄球菌A蛋白能與紅細(xì)胞膜上粘附的IC中的IgGFc片段相結(jié)合，而補(bǔ)體致敏的酵母菌能與紅細(xì)胞膜上未粘附IC的C3bR相結(jié)合，各自形成花環(huán)。 
紅細(xì)胞C3bR和免疫復(fù)合物花環(huán)率可作為紅細(xì)胞免疫粘附功能的指標(biāo)，如二項(xiàng)指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性細(xì)胞免疫功能低下，為紅細(xì)胞C3b受體受到破壞和影響所致；如果紅細(xì)胞C3bR花環(huán)率低，而紅細(xì)胞IC花環(huán)率高，為繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，是由于循環(huán)免疫復(fù)合物增加，紅細(xì)胞粘附IC過多引起。紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn)可同時(shí)顯示4種免疫功能狀態(tài)不同的紅細(xì)胞，SPA菌體花環(huán)為已全部被IC或抗RBC抗體粘附的紅細(xì)胞；酵母菌花環(huán)為未粘附IC或抗RBC抗體的紅細(xì)胞；混合花環(huán)為部分粘附IC或少許抗RBC抗體，并且C3b受體有空位的紅細(xì)胞；裸紅細(xì)胞為未粘附IC或抗體，并且C3b活性低（不能粘附補(bǔ)體致敏酵母菌）的紅細(xì)胞。 

二、材料與試劑 

離心機(jī)、恒溫水浴箱、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、小離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)管。酵母試劑、Hank’s液、豚鼠血清、動(dòng)物抗凝血、姬姆薩氏染色液。金黃色葡萄球菌SPA陽性株為Cowan I （ATCC12598或NCTC8530），陰性株為Wood46株等。 

三、操作方法 

1．紅細(xì)胞C3bR花環(huán)試驗(yàn) 
（1）C3b致敏酵母懸液制備：將酵母試劑用Hank’s液（含鈣、鎂、pH值7.2，下同）洗1次（1 000r/m離心10min），配成含酵母細(xì)胞1.00×108/ml的懸液，加等量新鮮豚鼠血清，混勻，37℃水浴20min。然后再以Hank’s液洗2次，恢復(fù)原濃度，即為C3b致敏酵母細(xì)胞懸液。酵母試劑用Hank’s液洗滌后，配成1.00×108/ml濃度，即為非致敏酵母懸液。 
（2）紅細(xì)胞懸液制備：將人或鼠、兔、牛、雞等被檢動(dòng)物的肝素抗凝血，用Hank’s液洗3次（每次以2 000r/min離心5min），zui后將紅細(xì)胞用Hank’s液稀釋成1.25×107細(xì)胞/ml的懸液。 
（3）檢測(cè)方法：取C3b致敏酵母菌懸濁液和紅細(xì)胞懸液各50μl，混勻，于37℃水浴40min后取出，輕輕搖起，加0.25%戊二醛溶液20μl固定5min，用適量Hank’s液稀釋，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆薩氏染色，高倍鏡檢查。 
2．紅細(xì)胞IC酵母花環(huán)試驗(yàn)除酵母細(xì)胞不致敏外，其余同紅細(xì)胞C3bR花環(huán)試驗(yàn)。 
3．紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn) 
⑴ 金黃色葡萄球菌SPA陰性和陽性菌的培養(yǎng)和懸液制備：以常規(guī)方法在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)金黃色葡萄球菌SPA陰、陽性菌，以Hank’s液洗下，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)使之達(dá)到6.25×103個(gè)菌/ml即為菌懸液。 
⑵ 補(bǔ)體致敏酵母菌和紅細(xì)胞懸液的制備：同紅細(xì)胞C3bR花環(huán)試驗(yàn)。 
⑶ 檢測(cè)方法：在小離心管內(nèi)加入上述待測(cè)細(xì)胞懸液50μl，補(bǔ)體致敏酵母菌懸液50μl混合，置37℃水浴30min，再加50μl SPA陰、陽性菌懸液混勻，37℃水浴30min，取出水平涂片，姬姆薩氏染色，顯微鏡油鏡檢查。 

四、結(jié)果判定 

1．紅細(xì)胞C3bR花環(huán)試驗(yàn)和IC酵母花環(huán)試驗(yàn) 以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母細(xì)胞為1個(gè)花環(huán)，計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，求出花環(huán)率。正常情況下，兩個(gè)試驗(yàn)均會(huì)看到在紅細(xì)胞周圍粘附幾個(gè)酵母細(xì)胞形成的花環(huán)，且紅細(xì)胞C3bR花環(huán)率大大高于紅細(xì)胞IC酵母花環(huán)率。如正常情況下，人的兩種花環(huán)率分別為25%～35%和3%～8%，雞的兩種花環(huán)率分別為9%～19%和3%～6%。但發(fā)生各種傳染病及腫瘤性疾病時(shí)，兩種花環(huán)率會(huì)發(fā)生變化。 
2．紅細(xì)胞SPA酵母混合花環(huán)試驗(yàn) 紅細(xì)胞上粘附2個(gè)以上酵母菌為C3b花環(huán)；粘附10個(gè)以上SPA菌體為IC花環(huán)；同時(shí)粘附10個(gè)SPA菌和2個(gè)酵母菌以上者為混合花環(huán)；未粘附SPA菌體與酵母菌者為裸紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，算出各自花環(huán)率。涂片染色后紅細(xì)胞為紅色，酵母菌為藍(lán)色，SPA菌體為小的淺藍(lán)色。 

五、注意事項(xiàng) 

1．不同動(dòng)物來源的補(bǔ)體對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果影響很大，因此檢測(cè)不同種屬來源的紅細(xì)胞，應(yīng)采用不同動(dòng)物的補(bǔ)體，如檢測(cè)人的紅細(xì)胞應(yīng)用豚鼠血清作補(bǔ)體，檢測(cè)雞的紅細(xì)胞應(yīng)以家兔血清作補(bǔ)體，檢測(cè)牛的紅細(xì)胞應(yīng)以小鼠血清作補(bǔ)體，補(bǔ)體來源不對(duì)，很難形成花環(huán)。 
2．補(bǔ)體血清及被檢紅細(xì)胞應(yīng)現(xiàn)采現(xiàn)用，不能馬上使用的，可暫存于4℃冰箱內(nèi)，但一般不超過6小時(shí)。 
3．試驗(yàn)管從水浴中取出搖勻時(shí)，要以腕力輕輕搖勻，不可振搖，涂片時(shí)，應(yīng)用毛細(xì)管吸1小滴于玻片上，并用平放的毛細(xì)管輕輕涂開即可，不可來回反復(fù)涂抹。 
4．所用Hank’s液pH值要調(diào)整準(zhǔn)確，否則不易形成花環(huán)。 
5．所用的SPA菌株是購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干制劑，經(jīng)分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)之后再使用。 

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