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士鋒生物T、B淋巴細胞分離實驗介紹
最近更新時間：2013-11-26
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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淋巴細胞主要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進行某些免疫學(xué)實驗時，首先需分離出純的T淋巴細胞和B淋巴細胞。本試驗的原理為：淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E—花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細胞分層液分離時，AET—E花環(huán)易沉于管底，而未形成E—花環(huán)的T淋巴細胞，用低滲液解花環(huán)周圍的AET—SRBC，便可獲得純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。
材料及試劑：
a）新鮮豚鼠血
b）兔紅細胞（RRBC）
c）溴花二氨基異硫氫化物（AET）
d）淋巴細胞分層液
e）其它hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽水，3.5%氯化鈉溶液，離心機等。
方法：
1.AET—RRBC制備
（1）.AET溶液的制備
稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143M溶液，用4NNaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。
（2）.AET處理RRBC
取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，zui后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。
（3）.1%AET—RRBC的配制：
將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。
2.從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。
3.AET—E花環(huán)試驗：
將分離的單個核細胞（2ⅹ106/毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。
4.T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離
將形成E—花環(huán)的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E—花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細胞群。