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士鋒生物補體介導的細胞毒試驗分析報告
最近更新時間：2013-12-3
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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【原理】
補體介導的細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity test）的原理是特異性抗體與細胞膜上相應抗原結(jié)合后，在補體的參與下，可產(chǎn)生細胞膜損傷，細胞死亡；不帶相應抗原的細胞仍然存活。利用染料排斥實驗判定淋巴細胞死活狀態(tài)，活細胞不著色，具有折光性，大小也正常。死細胞著色，體積增大。下面以HLA-A、B、C抗原檢測為例。
【材料】
1.Terasaki塑料板（60孔或96孔）、Fisher離心管、Fisher離心機、水平式離心機、倒置顯微鏡、血細胞計數(shù)板、普通顯微鏡、毛吸滴管、大試管、中試管、橡皮乳頭、溫箱、火花真空檢測器。
2.肝素抗凝劑（1000U/0.5ml/管）、Hanks液（pH7.2）、McCoy培養(yǎng)基、淋巴細胞分離液（比重1.077）、50 g/L 伊紅 Y、34-40%中性甲醛、生理鹽水、凝血酶。
3.兔補體 20只以上兔的新鮮血清混合而成，分裝于滅菌青霉素小瓶內(nèi)。在無HLA抗血清時應無淋巴細胞毒性；1；2稀釋應仍能使分型血清反應結(jié)果記分為8分（見本實驗結(jié)果判定）。不稀釋，-70℃儲存?zhèn)溆?。用前半小時，取出室溫融化，使用后剩余液棄去，不得反復凍融。
4.淋巴細胞懸液
（1）取肝素抗凝外周血10~15ml，1800rpm 離心10~15min。
（2）取白細胞層（1.0~1.5ml）加至含1.5 ml hanks液的中試管中。
（3）用毛吸滴管混勻，輕輕沿管壁加在盛有1.5 ml淋巴細胞分離液的離心管中，使之重疊于淋巴細胞分離液上，分層良好。
（4）2000 rpm 離心20min。
（5）吸取單個核細胞層細胞，加入Fisher離心管中，用Fisher離心機4000rpm 離心5min。
（6）棄上清，加Hanks液，1500rpm 離心10min，以去除血小板。
（7）棄上清（內(nèi)有血小板），加Hanks液混勻，加一滴凝血酶。
（8）轉(zhuǎn)動Fisher離心管，促凝，至血小板凝塊產(chǎn)生（約2 min左右）。
（9）1500 rpm 離心10min，使血小板凝塊沉淀。
（10）取上層懸液轉(zhuǎn)至新Fisher管中，1500 rpm 離心10min。
（11）棄上清（去除凝血酶），加Hanks液重懸細胞，1500 rpm 離心15min，棄上清，重復此步驟1次。
（12）棄上清，用McCoy液懸起細胞，并調(diào)整細胞濃度至1.5~2´106/ml。
（13）如細胞懸液中還含有紅細胞，可加抗A、抗B、抗H處理，去除。
5.HLA血清板
（1）取干凈Terasaki塑料板，各孔中加入一定量石蠟油。
（2）用干凈微量注射器加1ml各種已知的對照血清和特異性抗血清于相應各孔中。
（3）置-70℃或-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ū４嫫跒?~12個月）。
6.對照血清 陰性對照選用健康男性無輸血史的AB型血清，56℃30min滅活，或選用56℃30min滅活的健康人混合血清。陽性對照采用馬抗人淋巴細胞。
7.特異性抗體 采用經(jīng)產(chǎn)婦血清、多次受血者的血清、計劃免疫志愿者的血清、腎移植排斥者的血清或單克隆抗體。
【方法】
1.自-80℃冰箱中取出HLA血清板，在室溫下融化。
2.標記血清板，標明待檢細胞號碼。
3.將待檢的T淋巴細胞或總的外周淋巴細胞充分混合（1.5´106~2´106/ml）。
4.用軟滴法加1ml細胞懸液于各孔中，并使之與血清充分混合（用火花真空檢測器混勻），室溫（25℃）下30min。
5.每孔加兔補體5ml，室溫（25℃）下培養(yǎng)60min。
6.每孔加5ml伊紅染液，2 min后，加中性福爾馬林5ml于各孔中。
7.將50´75mm2玻片放在血清板上使各孔液滴扁平。置倒置顯微鏡下檢查細胞存活百分率。
【結(jié)果】
結(jié)果記錄以“6”或“8”為確切陽性反應。細胞死亡則被染料著色，細胞呈灰暗色，體積增大，說明細胞表面有與特異的HLA抗體相對應的抗原；如果淋巴細胞表面沒有與特異的HLA抗體對應的抗原，則細胞不著色（著色細胞數(shù)<10%~19%）?；蚣毎哂姓酃庑?，大小正常。
<10%細胞死亡，記1分，為陰性
11%~19%細胞死亡，記2分，為陰性
20%~29%細胞死亡，記4分，為陽性可疑
30%~80%細胞死亡，記6分，為陽性反應
>80%細胞死亡，記8分，為強陽性反應
在陰性對照和陽性對照結(jié)果均正確的情況下，按“多數(shù)反應原則”確定受檢細胞抗原。若結(jié)果異常，須仔細檢查每一步操作程序及試劑等是否符合要求，必要時重做。對于初學者，記4分的記錄，請有經(jīng)驗者復查及判定結(jié)果，不要輕易下結(jié)論。
【討論】
1.注意事項
（1）此試驗的關(guān)鍵在于獲得各種HLA標準抗血清，由于HLA抗體不是天然形成，不需經(jīng)同種異體抗原刺激產(chǎn)生。目前標準分型血清的主要來源是經(jīng)產(chǎn)婦和計劃免疫者。
（2）要注意淋巴細胞的存度與活性，因為粒細胞和單核細胞能非特異性地吞噬染料而造成細胞損傷的假象；明顯的粒細胞和血小板沾染能引起假陰性反應，因為它們與HLA抗體結(jié)合，減少結(jié)合到淋巴細胞上的抗體；紅細胞沾染，在倒置顯微鏡下很難與小淋巴細胞鑒別。為此本試驗用凝血酶等處理，盡量避免其他細胞（紅細胞、血小板、粒細胞和單核細胞）沾染。
（3）若測定HLA-DR、DQ抗原時，除淋巴細胞改用B細胞、標準分型血清改用HLA-DR、DQ分型血清及抗B淋巴細胞作陽性對照外，操作步驟（4）、（5）試驗條件分別改為37℃培養(yǎng)60min和25℃培養(yǎng)2h，其他與HLA-A、B、C抗原測定相同。
2.方法學評價
該法簡單易行，抗血清用量和細胞用量均極少，結(jié)果可靠，重復性好，無需特殊儀器設(shè)備，故為上普遍采用的標準方法。
3.臨床意義
HLA分型在免疫遺傳學、人類學、器官移植、臨床輸血、親子鑒定及疾病相關(guān)研究等許多領(lǐng)域都有十分重要的意義和用途。例如在器官移植時，為了提高器官移植的成功率，必須盡量選擇比較理想的供者。除ABO血型抗原必須相容外，供者的HLA抗原盡可能與受者接近，尤其是 HLA-D、DR抗原具有更重要意義。