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如何做好磷酸鈣-DNA共沉淀法實驗？
最近更新時間：2013-12-9
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在分子生物學中，磷酸鈣沉淀法特指將外源DNA轉入真核細胞的一種方法。將氯化鈣、DNA和磷酸緩沖液混合，形成吸附DNA的不溶性羥磷灰石細微顆粒附著在細胞表面，通過胞飲進入細胞。此方法對于貼壁細胞轉染是zui常用并的方法。
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。
下列是其實驗步驟：
一、配液
1. 2×HBS：1.63g NaCl;1.19g Hepes;0.023g Na2PO4-2H2O;加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存
2. 2mmol/L CaCl2 過濾除菌
3. TE：0.1mmol/L EDTA、1mmol/L Tris-HCL，PH8.0
4. G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。
5. G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的Dmem培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～800mg/L
注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的zui低濃度。
二、操作步驟[方法一]：
1.供體DNA制備：方法按DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
2. 受體細胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發(fā)轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104 /cm2 ，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培養(yǎng)，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。
3. DNA-磷酸鈣沉淀物的制備
① 將供體細胞DNA和PSV2-neo質粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質粒DNA液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo為1～2mg/L的使用量）。
② 取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。
③ 然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。
4. 轉染受體細胞
①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導轉染基因的表達。
⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。
⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。
⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進行化和擴大培養(yǎng)，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。
本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的DNA導入受體細胞即可，其方法如下：
三、DNA轉染[方法二]：
1. 配制磷酸轉染液：NaCl 8.0g;Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65;Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌，-20℃貯存?zhèn)溆?加溫水至 1000mL
2. 按前面介紹的方法提取癌細胞DNA。
3. 取供體DNA50～100μg，加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。
4. 再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。
5. 加入轉染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2 ，含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次（不用攪拌器以防DNA袢結），置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時，即可用于轉染細胞。
6. 取生長狀態(tài)良好處于半匯合階段的對數(shù)生長期細胞，在轉染前4小時，更換培養(yǎng)液（5ml/瓶）1次。
7. 轉染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時。
8. 培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。