士鋒生物神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)大全

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體外神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學(xué)研究中十分有用的技術(shù)手段。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是:（1）分散培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)成熟后,能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點(diǎn), 而且長(zhǎng)期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸,這就提供了體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程在體外重現(xiàn)的機(jī)會(huì)。（2）能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察活細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、形態(tài)和功能變化,便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標(biāo)記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進(jìn)行研究。（3）易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學(xué)和生物因子（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）等實(shí)驗(yàn)條件, 觀察條件變更對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接或間接作用。（4）便于從細(xì)胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制，藥物或各種因素對(duì)胚胎或新生動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞在生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等各方面的影響。 我們實(shí)驗(yàn)室從80年代始開展了神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)工作，取得了一些經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)將培養(yǎng)細(xì)胞分類及方法簡(jiǎn)要介紹如下:

一、雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)

主要用于神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物活性測(cè)定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經(jīng)突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和密度為指標(biāo)半定量評(píng)估NGF的活性。

1、材料和方法

（1）選正常受精的雞蛋，置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，每日翻動(dòng)雞蛋一次。

（2）取孵化8-12 d 的雞蛋, 用70% 酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。

（3）用彎鑷鉤住雞胚頸部，無(wú)菌條件下取出雞胚置小平皿內(nèi)，除去頭部后，腹側(cè)向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。

（4）在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側(cè)，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)（圖1），用一對(duì)5號(hào)微解剖鑷小心取出。

（5）置背根節(jié)于解剖溶液內(nèi)，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2、結(jié)果

雞胚背根神經(jīng)節(jié)在含神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF, 2.5S，20ng/ml）的無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)出密集的神經(jīng)突起。而未加NGF的神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)24 h, 未見神經(jīng)突起生長(zhǎng)。

二、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細(xì)胞培養(yǎng)

背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，NGF研究Levi-Montalcini的實(shí)驗(yàn)表明，外原性NGF能刺激DRG細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長(zhǎng)在一天之內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細(xì)胞，進(jìn)行軸突生長(zhǎng)發(fā)育的研究，是zui為經(jīng)典而常用的方法之一。

1、材料和方法

取新生一天的大鼠（wistar種）和小鼠（昆明種）。用眼科剪在無(wú)菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）分散后用種植（Plating）培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)（Feeding）培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L）;10%胎牛血清; 10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,）;5 % 馬血清; NGF 20ng/ml;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分細(xì)胞可貼壁, 呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細(xì)胞核位于中央或偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h, 大部分貼壁細(xì)胞開始長(zhǎng)出突起。其中多數(shù)為具有多個(gè)突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元, 突起細(xì)長(zhǎng),并可觀察到突起末端的生長(zhǎng)錐。除單個(gè)散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個(gè)或多個(gè)神經(jīng)元聚集在一起, 它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。 培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長(zhǎng), 形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密, 神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

4、新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)分化基本上與新生大鼠相似,但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。 神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。小鼠背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

5、雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元相比,神經(jīng)突起分枝較少。神經(jīng)元胞體稍小,神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

三、新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細(xì)胞培養(yǎng)

交感神經(jīng)系統(tǒng)在維持機(jī)體的正常功能和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)中起著十分重要的作用。交感神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)特別有助于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進(jìn)行交感神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質(zhì)表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過(guò)體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關(guān)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、激素，細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的的機(jī)制。

1、材料和方法

實(shí)驗(yàn)用出生當(dāng)天的昆明種小鼠，在無(wú)菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側(cè)的頸總動(dòng)脈,并以此為標(biāo)志,在頸總動(dòng)脈分為頸內(nèi)外動(dòng)脈交叉處找到上頸交感節(jié), 取出上頸交感節(jié), 置于含 1 % 膠元酶（Collagenase）和1 % 消化酶（Dispase）的2ml混合消化液中消化（37℃， 1 h）分散后，用種植（Plating）培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個(gè)細(xì)胞/ml密度的的細(xì)胞懸液;接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)（Feeding）培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液,以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L）;10%胎牛血清;10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM（含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,）;5%馬血清; NGF 20 ng/ml;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元在含 NGF 的培養(yǎng)液中種植后4h, 細(xì)胞即開始貼附在膠元薄膜或在皮層膠質(zhì)細(xì)胞層上生長(zhǎng), 交感神經(jīng)元的胞體一般為圓形, 有時(shí)亦可見橢圓或梭形,體積較大, 直徑約8-14μm左右,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈,神經(jīng)元的細(xì)胞核大多偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元 。接種后24h, 大部分貼壁神經(jīng)元開始長(zhǎng)出突起。培養(yǎng)2-3天后,神經(jīng)元突起逐漸增多并延長(zhǎng), 形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密。神經(jīng)細(xì)胞的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗, 神經(jīng)元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經(jīng)元可維持培養(yǎng)1-2個(gè)月。

四、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，脊髓是中樞的初級(jí)部分，其功能有二，一是傳導(dǎo)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)，二是完成軀體運(yùn)動(dòng)的基本反射。脊髓突然被橫斷并與中級(jí)失去后產(chǎn)生脊休克。因此，利用體外培養(yǎng)的脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行脊髓損傷和修復(fù)的研究日益受到重視。

1、材料和方法

用12-14d 胚齡的小鼠、12-14d 胚齡的大鼠、 孵化10 d 的雞胚，在無(wú)菌條件下取出胎鼠或雞胚脊髓，剝除脊膜后,將整個(gè)脊髓腹側(cè)面朝上置于平皿中，用微解剖鑷和雙面刀片沿脊髓中央管縱切兩半，再將脊髓兩側(cè)的腹側(cè)部分切下，將組織塊切碎， 用0.125% 胰蛋白酶消化（37℃ 30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5×105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液,接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液, 改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）進(jìn)行培養(yǎng)。以后每周換液兩次,每次更換50%的新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

胚鼠和雞胚脊髓腹側(cè)神經(jīng)元培養(yǎng)12h后,大部分神經(jīng)元可貼壁,貼壁神經(jīng)元呈圓形,直徑5-8μm,其中少數(shù)神經(jīng)元開始伸出1-2個(gè)突起。培養(yǎng)24h后, 神經(jīng)元突起逐漸增多并延長(zhǎng),形成稀疏的網(wǎng)絡(luò),培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元以雙極和多極為多見, 神經(jīng)元呈圓形或橢圓形及多邊形不等,胞核清楚,多數(shù)具1-2個(gè)核仁。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), 神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多、增粗并延長(zhǎng),形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò), 神經(jīng)元胞體逐漸增大。 多極胞體大的神經(jīng)元逐漸增多,經(jīng)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫組織化學(xué)染色和乙酰膽堿酯酶（AChE）組化染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。此后，只要定期換液并適當(dāng)抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和雞胚脊髓腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

五、新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)

海馬屬大腦邊緣系統(tǒng)，與情緒、學(xué)習(xí)及記憶有關(guān)，它具有明顯的長(zhǎng)突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)間程長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有協(xié)動(dòng)性、特異性、長(zhǎng)時(shí)性的特點(diǎn)，目前已被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。而且海馬組織常常是引起癲癇發(fā)作的病變部位，并且海馬細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧特別敏感。這些特征反映了海馬神經(jīng)元的內(nèi)在性。例如，對(duì)缺氧的可塑性和易感性均與NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受體的*性質(zhì)相關(guān)。海馬具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，有相對(duì)同源性的神經(jīng)元群體，據(jù)估計(jì)，海馬主要的細(xì)胞類型---錐體神經(jīng)元占海馬全部神經(jīng)元的85%-90%。海馬CA1和CA2區(qū)含有的錐體細(xì)胞在電生理特性及其相互連接的形式上各不相同，并能分別進(jìn)行培養(yǎng)。海馬錐體細(xì)胞具有特征性的形態(tài)，它們有單根軸突和數(shù)根樹突組成，所有的樹突都高度分化并密布樹突嵴。此外，海馬錐體神經(jīng)元相互之間與中間神經(jīng)元群體之間均有直接，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)缺乏外源性傳入纖維的情況下，海馬神經(jīng)元相互間仍然能產(chǎn)生廣泛的突觸。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)海馬，用0.125%胰蛋白酶消化（36℃、30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5×105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置標(biāo)本于36℃,含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。接種第5 d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5'-氟- 2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度增殖, 作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液,以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。

2、新生大鼠海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后12h,大部分細(xì)胞可貼壁,呈圓形, 其中少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞開始伸出1-2個(gè)突起。培養(yǎng)24h后,伸出突起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多, 突起一般為20-40μm,長(zhǎng)者可達(dá)60μm。培養(yǎng)3d后, 神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多并延長(zhǎng),形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)的海馬細(xì)胞以錐體細(xì)胞為多見,胞體較大,直徑6-12μm。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元胞體逐漸增大,胞突主干和分技明顯延長(zhǎng)并增粗,形成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)。海馬神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

六、新生大鼠隔神經(jīng)元分散培養(yǎng)

隔亦屬大腦邊緣系統(tǒng)，主要與一系例內(nèi)臟活動(dòng)、軀體活動(dòng)，情緒活動(dòng)有密切關(guān)系。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)隔區(qū)，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠隔神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠隔區(qū)培養(yǎng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本上與新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。但隔神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形, 直徑6-8μm。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元胞體逐漸增大,神經(jīng)突起逐漸增粗, 并互相聯(lián)絡(luò)成網(wǎng)。新生大鼠隔神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月。

七、新生大鼠下丘腦神經(jīng)元分散培養(yǎng)

下丘腦，作為神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的連接點(diǎn)，在神經(jīng)內(nèi)分泌研究中有很重要的地位。它不僅通過(guò)神經(jīng)-神經(jīng)，神經(jīng)—體液通路與垂體發(fā)生直接的，以興奮與抑制兩種不同的機(jī)制維持垂體內(nèi)分泌的相對(duì)恒定，而且與腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)邊緣系統(tǒng)等共同調(diào)節(jié)機(jī)體的各種活動(dòng)。下丘腦的分泌功能以及其所分泌的各種肽類激素、神經(jīng)多肽是下丘腦參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)、生理機(jī)能以及垂體內(nèi)分泌的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)下丘腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm,偶見胞體較大（直徑9-12μm）的多極神經(jīng)細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 下丘腦神經(jīng)元胞體逐漸增大。下丘腦神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

八、新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分散培養(yǎng)

大腦皮質(zhì)是大腦半球zui外表的一層灰質(zhì)，大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量極大，其類型也很多，但均屬多極神經(jīng)元，神經(jīng)元之間具有復(fù)雜的，反映皮質(zhì)的高度發(fā)展。有人從機(jī)能上將皮質(zhì)分為：感覺(jué)皮質(zhì)、聯(lián)絡(luò)皮質(zhì)、運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)皮層，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠皮層元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中既可見到體積較大（直徑8-12μm）的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞（如星狀細(xì)胞、籃狀細(xì)胞和梭形細(xì)胞）,也可見到馬提諾蒂細(xì)胞,胞體較小,呈三角形或多角形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起增粗。新生大鼠皮層神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月。

九、新生大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)

位于大腦皮質(zhì)下，緊靠丘腦背外側(cè)的幾塊灰質(zhì)，稱為基底神經(jīng)節(jié)，它們包括尾狀核、殼核和蒼白球，前兩者合起來(lái)又稱為紋狀體。紋狀體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部位，在這里進(jìn)行著運(yùn)動(dòng)機(jī)能的zui整合，它們與隨意運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定、肌緊張和軀體運(yùn)動(dòng)的整合有密切關(guān)系。中腦黑質(zhì)除含有較多的多巴胺（DA）神經(jīng)元外，還含有γ-氨基丁酸（GABA）神經(jīng)元等，紋狀體是其主要的靶組織，共同組成黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)。

十、新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)

黑質(zhì)由中腦背側(cè)的致密部和腹側(cè)的網(wǎng)狀部組成，中腦黑質(zhì)是多巴胺神經(jīng)元存在的部位，實(shí)驗(yàn)表明，大鼠中腦腹側(cè)多巴胺在運(yùn)動(dòng)和行為中起著關(guān)鍵性的作用。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退性病變可引起帕金森綜合癥。因此，多巴胺神經(jīng)元的體外培養(yǎng)為多巴胺神經(jīng)元的形態(tài)、受體分布、藥物作用、電生理特性的研究以及多巴胺神經(jīng)元移植研究提供了較好的實(shí)驗(yàn)手段。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)黑質(zhì)，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠下丘腦神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的中腦黑質(zhì)神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元,神經(jīng)元胞體呈橢圓形,直徑6-8μm，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 中腦黑質(zhì)神經(jīng)元胞體逐漸增大。中腦黑質(zhì)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

十一、新生大鼠小腦神經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)

小腦由外層的灰質(zhì)（皮質(zhì)）、內(nèi)部的白質(zhì)和三對(duì)深部的核團(tuán)（頂核、間位核和齒狀核）組成。與大腦皮質(zhì)相比，小腦皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元環(huán)路的組成相對(duì)簡(jiǎn)單，整個(gè)小腦皮質(zhì)共有三層結(jié)構(gòu)：分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒層。其中含有五種神經(jīng)元，即顆粒細(xì)胞，浦肯野細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、星形細(xì)胞和高爾基細(xì)胞。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中zui大的運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)，主要作用是維持軀體平衡，調(diào)節(jié)肌肉張力和協(xié)調(diào)隨意運(yùn)動(dòng)。小腦的另一個(gè)與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的重要功能是在技巧性運(yùn)動(dòng)的獲得和建立過(guò)程中發(fā)揮運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的作用。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，小腦細(xì)胞大小和形態(tài)的特征明顯，容易識(shí)別。另外，小腦缺陷神經(jīng)突變的小鼠種系比較多，這些條件都使小腦細(xì)胞成為發(fā)育研究的良好對(duì)象。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下取腦、分離出雙側(cè)小腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。

2、新生大鼠小腦神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠小腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本和新生大鼠皮層神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元以顆粒細(xì)胞為多見,體積較小,直徑3-5μm,亦可見到一定數(shù)量的星狀細(xì)胞,哺肯野細(xì)胞和籃狀細(xì)胞（胞體直徑6-8μm）,它們均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起逐漸增粗。新生大鼠小腦神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月。

十二、新生大鼠腦腺垂體細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠的垂體分為前、中、后三葉，前葉亦稱腺垂體，主要分泌生長(zhǎng)激素、催乳素、各種促激素及黑素細(xì)胞刺激素。因此建立體外培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞的方法，可用來(lái)探討各種因素直接對(duì)細(xì)胞分泌功能的影響，以及開展神經(jīng)內(nèi)分泌分子生物學(xué)的研究。

1、材料和方法

取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無(wú)菌條件下分離出腺垂體，用0.125%胰蛋白酶消化（36℃、30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成2×106個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液, 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置標(biāo)本于36℃,含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。

2、新生大鼠腦腺垂體細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)特征

接種后24h,新生大鼠腦腺垂體分散細(xì)胞即開始貼附在膠元薄膜上生長(zhǎng),腦腺垂體細(xì)胞zui初分散或聚集成小團(tuán),隨后迅速分裂增殖。細(xì)胞境界清楚, 形狀不規(guī)則,有圓形,卵圓或多角形。核位于胞體中央或偏于胞體一側(cè),可見1-2個(gè)核仁。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),腦腺垂體細(xì)胞胞體逐漸增大,形成單層, 鋪滿皿壁底層。腦腺垂體細(xì)胞可持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月。

十三、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

（一）雪旺細(xì)胞

雪旺細(xì)胞（Schwann cell，SC）是外周神經(jīng)系統(tǒng)zui主要的膠質(zhì)細(xì)胞，也是外周神經(jīng)的成髓鞘細(xì)胞;它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細(xì)胞的功能極其活躍，一旦神經(jīng)受損，它能反應(yīng)性分裂增殖，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附分子，對(duì)神經(jīng)元及其軸突起營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)作用。近年來(lái)的研究表明，雪旺細(xì)胞也能促進(jìn)中樞神經(jīng)對(duì)脫髓鞘損傷的修復(fù)，如對(duì)脊髓的再生，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對(duì)隔-海馬通路再生等。說(shuō)明雪旺細(xì)胞也能改善中樞神經(jīng)再生的微環(huán)境，因而近年來(lái)對(duì)雪旺細(xì)胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研究已成熱點(diǎn)。

1、材料和方法

雪旺細(xì)胞培養(yǎng)取材于各類哺乳動(dòng)物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，取孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒，在無(wú)菌條件下用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)，剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中, 種植密度為0.2×105 個(gè)細(xì)胞/ml，每皿2ml細(xì)胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3 d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進(jìn)一步去除成纖維細(xì)胞, 作用48小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)特征

培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細(xì)胞，雪旺細(xì)胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經(jīng)S-100免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。增殖分裂的雪旺細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）星形膠質(zhì)細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞中體積zui大，數(shù)量zui多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質(zhì)，星形膠質(zhì)細(xì)胞分兩類，一類為原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一種為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞（fibrous astrocyte），它的突起細(xì)長(zhǎng)，分枝少。纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞是與少突膠質(zhì)細(xì)胞源自同一前體細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多種功能，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質(zhì)細(xì)胞充填，起結(jié)構(gòu)的支持作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起構(gòu)成血腦屏障，星形膠質(zhì)細(xì)胞能攝取和代謝某些神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸等。調(diào)節(jié)局部神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能平穩(wěn)地發(fā)揮作用。還能吸收細(xì)胞間隙中過(guò)多的K+，為K+的存儲(chǔ)庫(kù)，通過(guò)調(diào)節(jié)K+的水平而影響神經(jīng)元的電生理活動(dòng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元生存和促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，亦能分泌白細(xì)胞介素，腫瘤壞死因子和干擾素等多種細(xì)胞因子，星形膠質(zhì)細(xì)胞有分裂能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，填補(bǔ)缺損，形成膠質(zhì)瘢痕。

（1）方法和結(jié)果

選擇出生 2 d 的SD大鼠，無(wú)菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化（37℃ 30min）后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 種植密度為1×105 個(gè)細(xì)胞/cm2，每瓶10ml細(xì)胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2 次，培養(yǎng)10-14h，細(xì)胞分為兩層，下一層為I型膠質(zhì)細(xì)胞即原漿形膠質(zhì)細(xì)胞，上一層是O-2A前體細(xì)胞，根據(jù)兩類細(xì)胞貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分選，在37℃搖床上振蕩，16 h（180r/min）O-2A前體細(xì)胞可被搖下來(lái)，搖下來(lái)的細(xì)胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20 % 胎牛血清促進(jìn)O-2A前體細(xì)胞分化為II型膠質(zhì)細(xì)胞即纖維型膠質(zhì)細(xì)胞?？煞至言鲋车脑瓭{形膠質(zhì)細(xì)胞和纖維型膠質(zhì)細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。純度鑒定可用膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體（GFAP）染色確定。

（三）少突膠質(zhì)細(xì)胞

1、方法和結(jié)果

少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法同星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。少突膠質(zhì)細(xì)胞比星形膠質(zhì)細(xì)胞小，光鏡下少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體呈圓形或多角形，突起呈串珠狀，根據(jù)其所在部位的不同可分為束間少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元周圍少突膠質(zhì)細(xì)胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，少突膠質(zhì)細(xì)胞主要形成及維持髓鞘。

討論

在神經(jīng)生理、生化和神經(jīng)藥理的研究中、神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)日益受到重視,因?yàn)樗茄芯繂蝹€(gè)神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經(jīng)節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎脊髓和不同腦區(qū) （海馬、隔、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細(xì)胞等）培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關(guān)。交感和感覺(jué)神經(jīng)元以及不同腦區(qū)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)成功, 為我們深入研究它們的結(jié)構(gòu)和功能提供了合適的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在背根?jié)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中, 我們觀察到, 早期感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)育階段,NGF是*的營(yíng)養(yǎng)因子,但在培養(yǎng)后期,神經(jīng)元已發(fā)育成熟, 可能非神經(jīng)細(xì)胞分泌的極少量NGF即能滿足神經(jīng)元生長(zhǎng)需要,因此不另NGF也能維持長(zhǎng)期培養(yǎng)。在上頸交感節(jié)細(xì)胞分散培養(yǎng)過(guò)程中, 我們亦觀察到,若zui初1-2d在培養(yǎng)液中缺乏 NGF,交感神經(jīng)元突起不見生長(zhǎng),且大多死亡。培養(yǎng)15d或1個(gè)月時(shí),如果培養(yǎng)液中未加入NGF, 本來(lái)生長(zhǎng)良好的神經(jīng)元很快便出現(xiàn)顆粒變性或空泡, 逐漸死亡。結(jié)果表明NGF對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)和維持神經(jīng)元生存有顯著作用。在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種因素的影響,其中細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育影響較大,一般神經(jīng)細(xì)胞的接種密度以0.5-1×106 個(gè)細(xì)胞/ml密度為宜,如每毫升中超過(guò)3×106個(gè)細(xì)胞/ml密度 ,將使細(xì)胞簇過(guò)大,而且培養(yǎng)皿內(nèi)過(guò)分擁擠, 影響存活和生長(zhǎng)。但如果培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目過(guò)少時(shí),神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化較差,因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞是一種細(xì)胞群體, 它們相互之間具有營(yíng)養(yǎng)和支持作用。其次是控制非神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)多增殖。原代分散單層培養(yǎng)是神經(jīng)細(xì)胞與非神經(jīng)細(xì)胞的混合培養(yǎng)。其中膠質(zhì)細(xì)胞等可在體外繼續(xù)增殖, 神經(jīng)元?jiǎng)t不能增殖而只能生長(zhǎng)分化。當(dāng)適量膠質(zhì)細(xì)胞的存在是神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的必要條件,但如果神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)渡增殖時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化便受到一定影響, 常使神經(jīng)細(xì)胞提早開始退化。這可能是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞頻繁分裂過(guò)程中, 奪取了神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)中需要的某種營(yíng)養(yǎng)成份。為保證神經(jīng)元生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng), 需在非神經(jīng)細(xì)胞增殖的高峰即所謂“合流”（confluence）時(shí),將一定量的抗DNA 藥物加入培養(yǎng)液中以抑制其過(guò)渡增殖,實(shí)驗(yàn)證明,在培養(yǎng)第5d 或第7d時(shí)使用 5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml,作用48h即停用可加快神經(jīng)元的分化, 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。再次是所配制的培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性, 溶解于培養(yǎng)基的物質(zhì)濃度所產(chǎn)生的等滲性必須與細(xì)胞外液的液體一致,培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞可將培養(yǎng)液的滲透壓調(diào)節(jié)到320-330 mOso 較為合適。如果培養(yǎng)液是高滲的,細(xì)胞會(huì)失去水份并發(fā)生皺縮, 如果培養(yǎng)液是低滲的, 細(xì)胞會(huì)吸收水分而膨脹。兩者不利于神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。 zui后需注意的是須掌握換液的次數(shù)和數(shù)量。為了使神經(jīng)細(xì)胞得到生長(zhǎng)分化必須的營(yíng)養(yǎng),必須經(jīng)常進(jìn)行換液,但如果換液次數(shù)太多,并不利于神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化,因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)液中需要適當(dāng)?shù)沫h(huán)境,而且它本身也有創(chuàng)造良好環(huán)境的能力, 如果頻繁換液就會(huì)破環(huán)這種環(huán)境。我們每周換液二次,每次只換一半, 保留一半原液。除此之外,培養(yǎng)液的PH、溫度等均對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育有影響,因而在實(shí)驗(yàn)中必須加以注意。
 

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