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如何用夾心法ELISA檢測人α2a,α2b干擾素（α2a,α2b）
最近更新時間：2013-12-13
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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重組人α2a/α2b干擾素（rHuIFN-α2a、rHuIFN-α2b）生產(chǎn)流程中*的一環(huán)是產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控，通常采用的是HEp-2/VSV或Wish/VSV系統(tǒng)檢測干擾素的生物活性。此系統(tǒng)常由于VSV或細胞的影響而不夠穩(wěn)定，且檢測周期較長。我們用自制的2種針對rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的單克隆抗體（McAb）建立了定量檢測rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的雙McAb夾心ELISA，敏感性達60pg/ml，結(jié)果與生物學(xué)活性檢測相對應(yīng)。試用于rHuIFN-α2a生產(chǎn)中的質(zhì)量控制取得了滿意的結(jié)果。此試劑盒也能檢測人體產(chǎn)生的天然α干擾素，有用于基礎(chǔ)和臨床疾病研究的潛力。
一、原理：選用2種針對rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b分子不同表位的McAb，1種McAb作為包被抗體，另1種McAb標記辣根過氧化物酶（HRP）作為結(jié)合物，催化底物顯色。根據(jù)標準品OD值繪制標準曲線，在標準曲線上查出待檢標本的含量。
二、試劑盒提供試劑（供檢測22份標本）
1. 包被抗體：應(yīng)用時用0.05M,pH9..6碳酸鹽緩沖液作100倍稀釋。
2. 酶標抗體：應(yīng)用時用0.1％BSA-PBS作200倍稀釋（售出前已稀釋10倍）。
3. 標準品：rHuIFN-α2a（3ng/ml），用時用0.1％BSA-PBS作倍比稀釋。
4. ABTS底物：ABTS 1mg＋0.1M,pH5.0檸檬酸緩沖液 2ml+3％ H２O２4μl（臨用時配）。
三、自備試劑和材料
1. 進口96孔或國產(chǎn)40孔聚苯乙烯elisa板（敏感性以進口板稍好）。
2. 0.1M,pH7.4 PBS配其它液體用。
3. 包被緩沖液：0.05M,pH9.6 Na２CO３-NaHCO３緩沖液。
4. 洗滌液：0.05％Tween 20-PBS。
5. 結(jié)合物稀釋液：0.1％BSA-PBS（用于稀釋標本、標準品和結(jié)合物）。
6. 底物緩沖液：0.1M,pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。
7. ELISA讀數(shù)儀等。
四、操作步驟
向ELISA板中加入稀釋好的包被抗體100μl/孔
↓ 4℃ 24～48h
洗3次，加入10倍連續(xù)稀釋的待測標本
?。ㄗ?個稀釋度即可）或倍比稀釋的標準品（6個稀釋度） 100μl/孔
↓37℃,1h
洗3次，加入稀釋好的酶標抗體100μl/孔
↓37℃,45min
洗4次，加入配好的ABTS底物液 100μl/孔
↓RT,30min
測410nm OD
↓
繪標準曲線
五、注意事項：
1. 待檢標本必須無污染，無溶血。
2. 標本稀釋后加入ELISA板時，注意從低濃度向高濃度依次加入。
3. 結(jié)合物稀釋液和底物緩沖液中禁止加入疊氮鈉。