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士鋒生物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
最近更新時(shí)間：2013-12-26
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T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細(xì)胞體積增大并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞，此稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，因此，可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。
本實(shí)驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中受有絲分裂原如植物血凝素刺激后，轉(zhuǎn)化為體積較大的母細(xì)胞，胞漿增多而深染，核增大并可見核仁裂，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的百分率可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。
【材料】
1．RPMLl640培養(yǎng)液(用前調(diào)至含小牛血清10％、青霉素100u／m1、鏈霉素μg/m1，用NaHCO3調(diào)pH至7.2-7.4)。
2．PHA（用RPMIl 640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成1000μg／m1）。
3．吉姆薩染液。
4．離心機(jī)、恒溫箱、計(jì)數(shù)器及顯微鏡等。
【方法】
1. 取無(wú)菌肝素抗凝血0.1m1，加入1.8m1細(xì)胞培養(yǎng)液中，同時(shí)加入PHA0.1m1，對(duì)照管不加PHA，將細(xì)胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)3天，每天搖動(dòng)1次。
2. 2500r／min，離心10min后棄上清液，留0.2m1沉淀細(xì)胞制片，迅速吹干。
3. 吉姆薩染色10一20min，水洗，干燥。
4. 油鏡計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率(圖6-1)。
【結(jié)果觀察】
1．淋巴母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構(gòu)造與
核仁的有無(wú)?？梢砸姷揭韵聨追N類型細(xì)胞（圖9-1）。
淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
圖9-1 T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
(1)成熟的小淋巴細(xì)胞：與未經(jīng)培養(yǎng)的小淋巴細(xì)胞一樣為6-8μm，核染色致密，無(wú)核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。
(2)過渡型淋巴細(xì)胞：比小淋巴細(xì)胞大，約l0-20μm，核染色致密，但出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)。
(3)淋巴母細(xì)胞：細(xì)胞體積增大，約20-30μm，形態(tài)不整齊，常有小突出，核質(zhì)染色疏松，有核仁l-2個(gè)，胞漿變寬，常出現(xiàn)胞漿空泡。
(4)其它細(xì)胞：如中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，絕大部分衰變或死亡，呈碎片。
2．淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：按上述分類檢查推片頭、體、尾三部分，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算過度型和淋巴母細(xì)胞百分率。在正常情況下，PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60％一80％，如為50％一60％則偏低，50％以下則為降低。
【注意事項(xiàng)】
1．培養(yǎng)基成分對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，注意其有效期。
2．小牛血清用前需滅活。
3．培養(yǎng)時(shí)要保證有足夠的氣體，
4．PHA劑量過大對(duì)細(xì)胞有毒性，PHA轉(zhuǎn)化反應(yīng)劑量一般10m1，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體總量不要超過2m1，太小不足以刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，試驗(yàn)前應(yīng)先測(cè)定。