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士鋒生物常用的標(biāo)記免疫酶及其底物詳細介紹
最近更新時間:2014-1-13
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1.標(biāo)記酶的選擇條件
⑴ 活性高,分解底物的能力強。
⑵ 特異性強,即作用于底物的專一性強。
⑶ 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。
⑷ 與底物作用可以顯色。
⑸ 純度高、易純化,即含雜蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好,在溶液中穩(wěn)定。
⑺ 測定方法簡單。
⑻ 酶來源方便、價格低廉。
2.符合條件的酶
⑴ 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP),分子量40 000。
⑵ 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP),分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶(β-galactosidase),分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase),分子量186 000。
其中以HRPzui為常用,因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點。
3.辣根過氧化物酶
HRP廣泛地分布于植物界,以辣根中含量zui高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白,含糖量18%,它由300個氨基酸和4個二硫鍵連接而成。分子量40 000,等電點5.5~9.0之間,它催化的zui適pH因供氫體不同而有所差異,但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。
HRP酶蛋白和其它雜蛋白的zui大吸收光譜為275nm,輔基部分的zui大吸收光譜為403nm,二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ>3為高質(zhì)量,RZ>2.5為中等質(zhì)量,RZ<2.5則需要純化。RZ值越小,表示雜蛋白越多,如RZ為0.6,則表示有75%的雜蛋白。
衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條,一個是純度即RZ值,一個是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前上規(guī)定,酶的活力以單位表示。一個酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進行酶的比較。
用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4.HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2,催化時需供氫體。
⑴ 組化法常用的供氫體是3,3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3-diamino-benzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合,形成不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合OSO4形成具有電子密度的產(chǎn)物,可適用于電子顯微鏡觀察。
⑵ 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。
表 ELISA的供氫體
供 氫 體 反應(yīng)顏色 波長 終止劑 終止
顏色 測定波長
聯(lián)大茴香胺(OD) 桔紅 512 5Mol/L HCI 黃 400
鄰苯二胺(OPD) 黃 444 2Mol/L H2SO4 桔黃 492
鄰苯甲苯胺(OT) 蘭 636 2Mol/L H2SO4 黃 442
5-氨基水楊酸 褐 475 1Mol/L NaOH 褐 449
以O(shè)D和OPDzui為常用。OPD有致癌作用,使用時需注意。
5.堿性磷酸酶
可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解釋放出無機磷酸而顯色?;蛘咄ㄟ^水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸,然后在還原劑作用下生成藍色的產(chǎn)物進行測定。