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士鋒生物噬菌體滴度的測(cè)定的方法

最近更新時(shí)間:2014-2-7

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詳細(xì)介紹:

在宿主細(xì)胞過(guò)量的情況下,噬斑的數(shù)量隨著噬菌體的增加呈線性增加。由于這個(gè)原因,在感染以前,要將噬菌體進(jìn)行稀釋,而不是將宿主細(xì)胞稀釋。以低MOI(感染重復(fù)性)鋪板,也可確保每一個(gè)噬斑僅包含一個(gè)DNA序列。
材料和試劑
1. 微波爐
2. LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板
3. lb培養(yǎng)基
4. 頂層瓊脂糖凝膠
操作步驟
1. 在5~10ml LB培養(yǎng)基中接種單個(gè)ER2537克隆,振搖孵育直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600~0.5)
2. 在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí),微波融化頂層瓊脂糖凝膠,分裝至無(wú)菌培養(yǎng)管內(nèi),每管3ml。維持在45℃?zhèn)溆谩?br />3. 37℃預(yù)熱LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板,備用。
4. 以LB培養(yǎng)基10倍比稀釋噬菌體。
建議稀釋范圍:對(duì)擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)上清,108-1011;對(duì)未擴(kuò)增的篩選洗脫液,101-104。每次稀釋都換用新的加樣槍頭,使用氣溶膠阻隔槍頭以避免交叉污染。
5. 一旦ER2537培養(yǎng)物長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,分裝至微量離心管中,每管200ml。
6. 將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細(xì)菌培養(yǎng)物的微量離心管中,一支微量離心管中僅加入一種稀釋液10ml,快速渦旋,室溫孵育1-5min。
7. 轉(zhuǎn)移至含有45℃頂層瓊脂糖凝膠的管中,快速渦旋混勻,立即傾倒至預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板上,輕緩搖動(dòng)平板使頂層膠均勻分布。
8. 冷卻平板5min,37℃倒置培養(yǎng)。
9. 噬斑計(jì)數(shù)以噬斑數(shù)為100左右的平皿為準(zhǔn),噬斑數(shù)乘以稀釋度即可獲得每10ml噬菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。

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