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士鋒生物真菌的DNA和RNA提取方法與操作步驟
最近更新時(shí)間：2014-2-10
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>37KB
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一、真菌dna的提取(方法一)
1.實(shí)驗(yàn)試劑
(1)DNA提取液：0.2M Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，0.01M EDTA，1%SDS
(2)3M NaAc
(3)TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)異丙醇
(7)無水乙醇
(8)75%乙醇
(9)rnaseA
2.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液，快速振蕩混勻
(3)加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min(此處是粗提沒有加酚，可以節(jié)約成本)
(4)1000rpm，4℃，5min
(5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm，4℃離心5min)
(6)取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
(7)用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL)，37℃處理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃離心5min)
(10)取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200ul TE中，-20℃保存?zhèn)溆?br />二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌絲0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min，期間混勻2-3次
3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min
4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4℃離心5min)
5.取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置約30 min
6.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL)，37℃處理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃離心5min)
9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200ul TE中，-20℃保存?zhèn)溆?br />DNA提取緩沖液：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.5M NaCl，2% CTAB(W/V)，4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二，是大同小異。主要是DNA提取液配方不一樣!成本也不一樣!