士鋒生物PCR-酶聯(lián)免疫法檢測(cè)端粒酶活性攻略

最近更新時(shí)間：2014-2-12

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相關(guān)產(chǎn)品：

端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，端粒DNA是一系列重復(fù)的富含G的DNA序列，這一序列在生物進(jìn)化中有高度的保守性(人重復(fù)序列為TTAGGG)。已確認(rèn)端粒在保護(hù)基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結(jié)合(如染色體末端融合、重排、染色體移位和染色體缺失)中起重要作用。
由于dna聚合酶不能復(fù)制線性DNA的zui末端，多數(shù)正常體細(xì)胞的端粒末端每經(jīng)一個(gè)復(fù)制循環(huán)就進(jìn)行性縮短。這一現(xiàn)象在體內(nèi)和體外都得到證實(shí)，并且可能與真核生物的正常體細(xì)胞有限的繁殖能力有關(guān)。
這一活性可能在與細(xì)胞衰老有關(guān)的情況中起作用。與體細(xì)胞相對(duì)照，生殖細(xì)胞是永生性的，它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對(duì)抗端?？s短。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復(fù)序列而完成。
端粒酶是一種核糖核蛋白，它們用自身的RNA成份的互補(bǔ)序列作模板，催化TTAGGG重復(fù)序列加到染色體末端。在大多數(shù)永生性細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株中也可見端粒酶活性的表達(dá)。端粒酶反應(yīng)超越了細(xì)胞的增殖限制，這可能是惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)先決條件。
傳統(tǒng)的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎(chǔ)測(cè)定端粒酶活性。由于需要大量的樣品材料，且檢驗(yàn)靈敏度受局限, 這一方法已被端粒重復(fù)擴(kuò)增法(omeric Repeat Amplification Protocol, TRAP)所取代。
標(biāo)準(zhǔn)的TRAP測(cè)定是通過pcr擴(kuò)增端粒酶反應(yīng)的產(chǎn)物，使用放射性標(biāo)記，經(jīng)凝膠電泳后，通過放射自顯影顯示結(jié)果。
這里介紹使用非放射性標(biāo)記的檢測(cè)端粒酶的新方法：活性光密度酶聯(lián)免疫測(cè)定法。這種方法具有如下特點(diǎn)：
安全，無需使用放射性同位素
一步反應(yīng)，使用即用的混合物使端粒酶介導(dǎo)的引物延伸和PCR擴(kuò)增可在一個(gè)試管中進(jìn)行。
應(yīng)用廣泛，擴(kuò)增后可適用于不同分析法。
靈敏，與放射性同位素TRAP測(cè)定相當(dāng)。
可靠，準(zhǔn)確、重復(fù)性好。
快速，6-8小時(shí)得到結(jié)果。
現(xiàn)介紹如下：
1.原理：
本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基礎(chǔ)上的，它將端粒酶介導(dǎo)的衍生產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 并與后序的ELISA法結(jié)合在一起。 本法可分如下幾步：
(1)延伸/擴(kuò)增：
*步：端粒酶將端粒重復(fù)序列(TTAGGG)加到帶有生物素標(biāo)記的P1-TA引物的3’末端。
第二步：利用引物P1-TS和T2通過PCR擴(kuò)增這些延伸出的產(chǎn)物，產(chǎn)生出的PCR產(chǎn)物帶有特異的端粒酶-6-核苷酸的延伸產(chǎn)物。
(2)ELISA測(cè)定：
PCR產(chǎn)物變性后與Dig標(biāo)記的端粒特異的重復(fù)檢測(cè)探針雜交。終產(chǎn)物可經(jīng)生物素標(biāo)記的探針固定到親和素包被的微量滴定板上。固定的PCR產(chǎn)物可用與過氧化物酶交聯(lián)的抗地高辛復(fù)合物(anti-Dig-POD)檢出。zui后，經(jīng)過分解底物TMB形成一種有色的反應(yīng)物，再用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
2.應(yīng)用：
本法可用于從培養(yǎng)細(xì)胞和其他生物樣品的抽提物進(jìn)行端粒酶活性的高敏感性檢測(cè)。
3. 檢測(cè)步驟：
3.1 樣品制備：
3.1.1 細(xì)胞提取物的制備：
—按標(biāo)準(zhǔn)方法采集并進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)(trygan染色，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。)
—每個(gè)反應(yīng)取2*105細(xì)胞移入一個(gè)新的試管。
—2-8℃下以3000g離心10分鐘形成細(xì)胞團(tuán)。
—小心移去上清液，將細(xì)胞在PBS中重懸并重復(fù)離心步驟。
—小心移去上清液，細(xì)胞小團(tuán)可放在-80℃下儲(chǔ)存。
—若準(zhǔn)備細(xì)胞提取物，將細(xì)胞小團(tuán)在200ul裂解試劑中重懸，冰上預(yù)冷并提吸至少3次，冰中孵育30分鐘。如果將冷凍細(xì)胞團(tuán)用于提取，加入裂解液前在冰上融化細(xì)胞團(tuán)。
—2-8℃，16000g離心裂解物20分鐘。
—小心移去上清液并移入新的離心管中。保證將細(xì)胞殘?jiān)鼛?，我們推薦僅抽吸175ul細(xì)胞提取物。
—繼續(xù)進(jìn)行TRAP反應(yīng)。
—如不立即進(jìn)行TRAP反應(yīng)，將小份細(xì)胞抽提物在液氮中休克性冷凍，將提取物儲(chǔ)存在-80℃。
3.1.2 組織中提取物的制備：
—測(cè)定端粒酶活性的組織標(biāo)本準(zhǔn)備，需要小心的采樣并保存臨床材料，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的污染可產(chǎn)生正常組織中的假陽性信號(hào)，而由于不恰當(dāng)?shù)谋４嬉部稍谀[瘤樣本中產(chǎn)生陰性信號(hào)。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA組織樣本應(yīng)以小片在液氮中休克性冷凍，并保存在-80℃。
—冰上孵育30分鐘。
—2-8℃，16000g離心細(xì)胞裂解液20分鐘?？捎美鋬雠_(tái)式離心機(jī)及離心管。
—小心將上清液移入新的離心管中，確保無組織殘片被帶入，我們建議僅抽提175ul組織提取物，以標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白濃度，在液氮中休克性冷凍小份組織提取物，將提取物存放在-80℃。
3.2 端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增步驟(TRAP反應(yīng))。
—對(duì)于每一待例檢測(cè)樣本，先將25ul反應(yīng)復(fù)合物加入適合PCR擴(kuò)增的管中，加入1-3ul細(xì)胞提取物(相當(dāng)于1*103-3*103細(xì)胞或1-50ug總蛋白)。并加入無菌水至總體積50ul，所有吸取步驟在冰上進(jìn)行。
—將離心管置于PCR儀中，照下列步驟進(jìn)行引物延伸/擴(kuò)增反應(yīng)。
3.3 雜交及ELISA反應(yīng)流程：
—每個(gè)樣品取20ul變性試劑加入適宜的離心管中，若有大量樣本，建議使用無核酸酶包被的微孔板MTP。
—加入5ul擴(kuò)增產(chǎn)物，15-25℃孵育10分鐘。
—每個(gè)離心管內(nèi)加入225ul雜交緩沖液，用振蕩器*混勻。
(如需要，雜交混合物量可以用于二次檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。)
—取出100ul混合物加入試劑盒中已包被的微孔板的每個(gè)孔中，并用蓋子蓋住小孔以防蒸發(fā)。
—將MTP微孔板置于37℃，300rpm的振蕩器中孵育2小時(shí)。
—棄去全部雜交液，以清洗緩沖液洗三次，每孔250ul每次至少30秒，小心棄去沖洗液。
—每孔加入100ul抗-DIG-POD工作液，用蓋子蓋上MTP，15-25℃(18-22℃)置于300rpm的搖床上孵育30分鐘。
—*棄去溶液，以每孔250ul清洗緩沖液沖洗5次，每次至少30秒，小心棄去沖洗緩沖液。
—每孔加入100ulTMB底物溶液預(yù)熱至室溫，蓋上蓋子，在300rmp的搖床上孵育10-20分鐘。
——不要移去反應(yīng)底物，每孔加入100ul終止試劑以終止反應(yīng)。
注意：加入終止液后等已反應(yīng)的POD底物的顏色從藍(lán)轉(zhuǎn)黃，這是取得zui高敏感度所必要的。
——使用ELISA酶標(biāo)儀，測(cè)定加入終止液后30分鐘內(nèi)標(biāo)本450nm吸收值(參照波長為690nm)。
4.結(jié)果分析：
吸光值為A450nm，參照空白對(duì)照讀數(shù)(A690nm)。
4.1 陰性對(duì)照：
將細(xì)胞提取物與無DNA酶的RNA酶預(yù)孵育，降解端粒酶內(nèi)源性RNA作為檢測(cè)端粒酶的陰性對(duì)照，另一種方法為熱處理以取得陰性對(duì)照。用RNA酶處理標(biāo)本，陰性對(duì)照zui大的吸收值為0.2450nm-690nm，如果數(shù)值較高，整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括TRAP反應(yīng)需重新進(jìn)行。
4.2 陽性對(duì)照：
陽性對(duì)照的吸收值在底物反應(yīng)20分鐘后檢測(cè)，應(yīng)高于1.5(A450nm-A690nm)，相當(dāng)于使用1*103細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。如果數(shù)值較低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括TRAP反應(yīng)需重新進(jìn)行。
4.3 樣本：
將樣本的吸收值減去陰性對(duì)照的值。如果吸收值的差異(ΔA)高于0.2(A450nm-A690nm)可認(rèn)為端粒酶陽性。
5. 常見問題分析及解決方案
1 陽性對(duì)照信號(hào)過低或無
1) 所用熱循環(huán)儀的型號(hào)不適合所設(shè)的熱循環(huán)程序，選擇適宜的循環(huán)條件。
2) 引物延長、擴(kuò)增所用的水含有核酸酶。必須使用無核酸酶的重蒸水(DEPC或Velcorin處理)來制備試劑。
3) 試劑受核酸酶污染。另換陽性對(duì)照細(xì)胞提取物及樣本重復(fù)全部檢測(cè)。仔細(xì)檢查是否污染了DNA酶及RNA酶。
4) 孵育步驟未在300rmp振蕩器下進(jìn)行。選用合適的振蕩器。
5) 抗DIG-POD工作液失效，必須使用新準(zhǔn)備的抗DIG-POD工作液，檢查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并準(zhǔn)備新鮮的工作液。
2 陰性對(duì)照信號(hào)過高
1) 陰性對(duì)照、裂解試劑、或反應(yīng)混合物被端粒酶陽性細(xì)胞提取物污染，以RNA酶處理或65℃熱處理10分鐘是陰性對(duì)照失活。重復(fù)包括擴(kuò)增在內(nèi)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)。
2) 陰性對(duì)照、裂解試劑、反應(yīng)復(fù)合物、或其它試劑可能被以前實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物所污染。
3) 在檢測(cè)步驟中，沖洗不充分，增加沖洗步驟。
4) 與TMB底物溶液的孵育過長，加入TMB底物溶液20分鐘內(nèi)停止底物反應(yīng)。
本文介紹的方法可應(yīng)用于端粒酶活性的高敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中。是結(jié)合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和ELISA兩種實(shí)驗(yàn)技能的端?；钚詸z測(cè)方法，整個(gè)過程應(yīng)注意在低溫條件下進(jìn)行，另外，實(shí)驗(yàn)中需要用到的試劑、管子、槍頭等應(yīng)洗滌干凈，避免PCR殘余污染。

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