士鋒生物雙鏈短RNA（dsRNA）阻斷基因表達(dá)機(jī)理及雙鏈RNA的構(gòu)建

最近更新時(shí)間：2014-2-18

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一. RNAi的機(jī)理
目前RNAi的作用機(jī)理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內(nèi)闡明的。生物體內(nèi)的雙鏈RNA可來(lái)自于 RNA病毒感染，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，外源導(dǎo)入的基因。這些來(lái)源的雙鏈RNA誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)制，結(jié)果是病毒被清除，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)被阻斷，外源導(dǎo)入基因表達(dá)被阻斷同時(shí)，與其同源的細(xì)胞基因組中的基因表達(dá)也被阻斷。
㈠ 參與rnai反應(yīng)的酶
RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶，參與RNAi反應(yīng)的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一個(gè)成員。 Dicer酶廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動(dòng)物體內(nèi)。它的結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合位點(diǎn)。在 Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個(gè)核苷酸的片斷，稱為sirna(short interference RNA)[2]，它啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi反應(yīng)。
由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中，研究者們推測(cè)細(xì)胞內(nèi)存在 RNAi效應(yīng)的擴(kuò)增系統(tǒng)。研究者們發(fā)現(xiàn)，在真核細(xì)胞中也存在能以RNA為模板指導(dǎo)rna合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP)。在RdRP的作用下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA通過(guò)類似于PCR的反應(yīng)過(guò)程，呈指數(shù)級(jí)的數(shù)量擴(kuò)增。
㈡ RNAi的反應(yīng)過(guò)程
雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前*已知的參與復(fù)合物形成的蛋白[3]。此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在 RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈[4，5]。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的 siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。從21到23個(gè)核苷酸的 siRNA到幾百個(gè)核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長(zhǎng)的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA。
二. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNAi
在小鼠的胚胎細(xì)胞中也存在RNAi，將727個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA轉(zhuǎn)入小鼠的畸胎瘤細(xì)胞，誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)制，并抑制了報(bào)告基因的表達(dá)[6]。但大于30個(gè)核苷酸的雙鏈RNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物的成體細(xì)胞后，會(huì)非特異的阻斷基因的表達(dá)。這是由于當(dāng)長(zhǎng)的雙鏈RNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的病毒防御機(jī)制被激活。細(xì)胞內(nèi)干擾素產(chǎn)生增加，蛋白激酶PKR激活，使轉(zhuǎn)錄因子E2F被抑制，非特異的阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNase L)被激活，產(chǎn)生非特異的mRNA降解。而未分化的胚胎細(xì)胞中，上述防御病毒的機(jī)制存在缺陷，因而 雙鏈RNA能特異的阻斷基因的表達(dá)。
由于大于30個(gè)核苷酸的雙鏈RNA非特異的阻斷哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞中的基因表達(dá)，RNAi在哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞中的應(yīng)用受到限制。但Tuschl等人的研究工作克服了這一障礙。他們發(fā)現(xiàn)，21個(gè)核苷酸的雙鏈RNA能夠誘發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的RNAi機(jī)制，同時(shí)不會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的干擾素 [7]。他們合成了以熒光素酶的mRNA為靶分子的21個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，將它和熒光素酶的表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到NIH3T3,COS- 7,Hela S3,293細(xì)胞中，報(bào)告基因的表達(dá)被抑制了90%。由于報(bào)告基因得到的結(jié)果不能*說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的情況，他們又合成了細(xì)胞內(nèi)源性基因laminA/C為靶目標(biāo)的雙鏈RNA，這個(gè)雙鏈RNA也特異的抑制了laminA/C的表達(dá)，抑制率達(dá)到90%以上。
根據(jù)一條mRNA的不同靶位點(diǎn)可以合成出許多條雙鏈RNA，研究發(fā)現(xiàn)這些雙鏈RNA的作用差別很大 [8]。其中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，編碼區(qū)的3’末端為靶點(diǎn)的雙鏈RNA的效果很差。而GC含量低的區(qū)域似乎雙鏈RNA的效果好。線蟲內(nèi)的siRNA可以作為引物，以靶mRNA為模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量擴(kuò)增siRNA。將siRNA的3’末端標(biāo)記上FITC使它喪失引物的作用，在將其轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，它抑制靶基因的作用并沒有受到影響。因而研究者推測(cè)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不存在象線蟲那樣的依賴于RDRP的RNAi放大機(jī)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染dsRNA后，dsRNA的作用只維持了三天。而將表達(dá)dsRNA的載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后篩選出的穩(wěn)定表達(dá)株中，在轉(zhuǎn)染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表達(dá)[9]。利用載體表達(dá)出的dsRNA為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其環(huán)狀部位的核苷酸的序列和數(shù)目對(duì)dsRNA的作用都有影響，研究者發(fā)現(xiàn)9個(gè)核苷酸比5個(gè)或7個(gè)核苷酸的效果好[9]。DsRNA的作用很強(qiáng)，在1nM時(shí)就能有效的阻斷靶基因的表達(dá)。RNAi還具有很高的特異性。19個(gè)核苷酸的 dsRNA幾乎可以*抑制基因的表達(dá)，而將其中的一個(gè)核苷酸突變掉后，它對(duì)基因的抑制作用就消失了[9]，這對(duì)dsRNA的應(yīng)用是非常重要的，這可以避免dsRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。
三. 雙鏈RNA的構(gòu)建
雙鏈RNA可先在體外構(gòu)建好，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在體外構(gòu)建雙鏈RNA時(shí)，分別在體外轉(zhuǎn)錄出正義和反義 RNA，再將兩者退火，形成雙鏈RNA。體外合成的雙鏈RNA可以用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。但有些細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA半衰期短。而先在體外構(gòu)建能表達(dá)雙鏈RNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類，而且在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中，雙鏈RNA能夠長(zhǎng)期發(fā)揮阻斷基因的作用。
在構(gòu)建雙鏈RNA的表達(dá)載體時(shí)，使用RNA多聚酶Ⅲ來(lái)指導(dǎo)RNA的合成。這是因?yàn)镽NA多聚酶Ⅲ有明確的啟始和終止序列，而且合成出的RNA不會(huì)帶有polyA尾。當(dāng)RNA多聚酶Ⅲ遇到連續(xù)5個(gè)胸腺嘧啶時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)終止，并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二個(gè)尿嘧啶處被切下來(lái)。U6啟動(dòng)子能被RNA多聚酶Ⅲ識(shí)別， 合成出RNA。ShiYang[10]等人用Bluescript作為載體，U6作為啟動(dòng)子，從綠色熒光蛋白(GFP)的基因上選擇了一個(gè)21個(gè)核苷酸的片斷(片斷1)，將其插入到Bluescript載體中。然后合成出片斷1的反向重復(fù)序列，并在其后加了5個(gè)胸腺嘧啶，稱為片斷2。他們將片斷2接到 Bluescript載體中片斷1的后面，將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中后，轉(zhuǎn)錄出的RNA由于具有回文序列，會(huì)形成一個(gè)發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，從而得到了雙鏈RNA。片斷后面加了5個(gè)胸腺嘧啶，RNA轉(zhuǎn)錄到這個(gè)位置時(shí)就會(huì)終止。而且轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)后，會(huì)在3’端形成2個(gè)突出的尿嘧啶，這類似于天然的 siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發(fā)RNAi。
RNA多聚酶Ⅲ還能識(shí)別H1-RNA 啟動(dòng)子。在H1-RNA 啟動(dòng)子后面接上能形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的反向互補(bǔ)序列，將此載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后也能在細(xì)胞內(nèi)合成dsRNA[9]。
T7也可作為啟動(dòng)子合成dsRNA。將PCR產(chǎn)物用NotI酶切后自身連結(jié)，回收正向片斷和反向片斷連結(jié)形成的具有反轉(zhuǎn)重復(fù)序列的片斷，接到pGEMTeasy載體上，就構(gòu)建成了可以表達(dá)dsRNA的載體。用此載體可先在體外合成dsRNA,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)合成dsRNA。在后一種情況下，還須將能表達(dá)T7RNA多聚酶的載體也一起轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，以提供能識(shí)別T7啟動(dòng)子的RNA多聚酶[11]。
雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá)。而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達(dá)的時(shí)間。在小鼠畸胎瘤細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，C2C12細(xì)胞中，用長(zhǎng)鏈具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA有效的阻斷了報(bào)告基因的表達(dá)，在穩(wěn)定表達(dá)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA 的細(xì)胞株中，報(bào)告基因的表達(dá)被長(zhǎng)期的阻斷了[12]。
腺病毒是體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內(nèi)和體外表達(dá)dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了成體動(dòng)物的基因敲處[13]。
四. RNAi的應(yīng)用
1. 高通量的研究基因功能
在后基因組時(shí)代，需要大規(guī)模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能特異的阻斷基因的表達(dá)，因而RNAi成為研究基因功能的很好的工具。研究者將線蟲三號(hào)染色體上2232個(gè)基因?qū)?yīng)的dsRNA合成出來(lái)，并注射到線蟲性腺內(nèi)，然后觀察子代細(xì)胞分裂時(shí)出現(xiàn)的異常表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了133個(gè)基因與細(xì)胞分裂異常有關(guān)。其中104個(gè)基因以前沒有發(fā)現(xiàn)有這種功能。在另外一項(xiàng)研究中，線蟲一號(hào)染色體上的2416個(gè)基因?qū)?yīng)的dsRNA被構(gòu)建到細(xì)菌文庫(kù)中，然后將細(xì)菌喂給線蟲，觀察形態(tài)學(xué)的異常，異常的運(yùn)動(dòng)，性別比例的變化，不孕的情況，結(jié)果將于這些表型有關(guān)的基因從70個(gè)增加到178個(gè)。
2. 基因敲除
在線蟲的體內(nèi)外試驗(yàn)中，RNAi都能達(dá)到基因敲除的結(jié)果，從而成為研究這些基因功能的良好工具。對(duì)于哺乳動(dòng)物，RNAi能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到基因敲除的效果，對(duì)于一些敲除后小鼠在胚胎時(shí)就會(huì)死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。由于RNAi能特異的阻斷基因的表達(dá)，它成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。在線蟲體內(nèi)，胰島素和受體結(jié)合后可以活化DSOR1,它是MEK的類似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的類似物。用以DSOR1為靶目標(biāo)的dsRNA可以阻斷DSOR1的表達(dá)，雖然總的ERKA的表達(dá)不受影響，但由于DSOR1的表達(dá)被抑制，因而胰島素刺激后ERKA不能活化。RNAi還被用來(lái)研究在發(fā)育過(guò)程中起作用的基因，如可用RNAi來(lái)阻斷某些基因的表達(dá)，來(lái)研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中其起著關(guān)鍵作用。
3. 基因治療
目前抑制基因表達(dá)常采用反義技術(shù)或轉(zhuǎn)入沒有功能的突變體與該基因競(jìng)爭(zhēng)。這兩種方法對(duì)基因表達(dá)的抑制都不如RNAi特異持久。作為基因治療的工具，RNAi既特異，又簡(jiǎn)便易行。RNAi在某個(gè)基因表達(dá)異常增高引起的疾病中會(huì)非常有用，如病毒感染，腫瘤等。CDK-2是調(diào)控細(xì)胞周期的一個(gè)關(guān)鍵基因，用以CDK-2位靶目標(biāo)的dsRNA能阻斷99.7%的細(xì)胞中CDK-2的表達(dá)，而在對(duì)照中只有0.2% 的細(xì)胞中CDK-2基因的表達(dá)降低[10]。因而，以CDK-2位靶目標(biāo)的dsRNA能治療細(xì)胞異常增殖相關(guān)的疾病，如腫瘤等。DsRNA還可以抗病毒治療。研究者們將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，rev基因的表達(dá)被顯著抑制[14]。CD4基因編碼細(xì)胞表面 HIV病毒的受體，用針對(duì)CD4的dsRNA能將細(xì)胞表面HIV病毒的受體表達(dá)減少75%，從而抵抗HIV病毒的感染。
4. 基因表達(dá)調(diào)控
今年研究者發(fā)現(xiàn)RNAi在Epigenetics中發(fā)揮重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表達(dá)的改變，而基因的編碼沒有改變。今年研究者發(fā)現(xiàn)，epigenetics調(diào)控的一種類型是染色體的改變。通過(guò)改變?nèi)旧w的形狀(更緊或是更松)，能夠決定那一個(gè)基因表達(dá)。但什么促進(jìn)了染色體形狀的改變以前并不清楚。今年研究者發(fā)現(xiàn)，siRNA在染色體形狀的改變中起著非常重要的作用。這樣 RNAi能*的關(guān)閉基因的表達(dá)，而不僅僅是短期的抑制它。通過(guò)在發(fā)育過(guò)程中關(guān)閉或開放基因的表達(dá)，siRNA可能指導(dǎo)著細(xì)胞的定向分化。RNAi已被證實(shí)能引導(dǎo)植物干細(xì)胞的分化，因而研究者認(rèn)為RNAi也可能參與指導(dǎo)人的干細(xì)胞的分化。由于RNAi在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，對(duì)RNAi微小的干擾就可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
目前RNAi在非脊椎動(dòng)物如線蟲，果蠅，以及植物中的應(yīng)用已經(jīng)取得了很多重要的成果，但在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于起步階段。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi并不能*阻斷基因的表達(dá)，特別是表達(dá)異常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三個(gè)基因被抑制了 90%，但有一個(gè)基因沒有被抑制，這就是一個(gè)表達(dá)很高的基因。另外，運(yùn)載體系一直是體內(nèi)基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA特異的轉(zhuǎn)入體內(nèi)仍是一個(gè)難題。目前已能用腺病毒作為載體在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)RNAi,但仍需要尋找更為安全有效的載體。
近年來(lái)RNAi取得很多突破性的研究，RNA干擾越來(lái)越多的應(yīng)用于基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因治療、生物發(fā)育、細(xì)胞分化等領(lǐng)域。

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