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士鋒生物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定
最近更新時(shí)間：2014-3-6
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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一、原理
苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）催化苯丙氨酸的脫氨反應(yīng)，使NH3釋放出來(lái)形成反式肉桂酸。此酶的在植物體內(nèi)次生物質(zhì)（如木質(zhì)素等）代謝中起重要作用。根據(jù)其產(chǎn)物，反式肉桂酸在290nm處吸光度的變化可以測(cè)定該酶的活性。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：馬鈴薯塊莖
（二）儀器設(shè)備：1. 紫外分光光度計(jì)；2. 離心機(jī)；3. 研缽；4. 吸濾瓶；5. 紅光裝置；6. 打孔器。
（三）試劑：1. 0.05mol/L 硼酸鹽緩沖溶液（pH8.8）；2. 0.02mol/L 苯丙氨酸（用0.1mol/L pH8.8硼酸緩沖液配制）；3. 5mmol/L 巰基乙醇硼酸緩沖液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 馬鈴薯圓片制備 將馬鈴薯塊莖洗凈、削皮，用打孔器（直徑1.5cm）取圓柱，切除兩頭近表皮處，中間部分切成2mm厚的圓片。先用自來(lái)水漂洗，zui后用蒸餾水洗一次，用紗布吸干表面的水。
2. 光誘導(dǎo) 將圓片平鋪在濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置20～30℃紅光下處理24h以誘導(dǎo)PAL（也可接種病原菌誘導(dǎo)等）。
3. 酶粗提液的制備 經(jīng)誘導(dǎo)處理的馬鈴薯圓片5g，加10ml含5mmol/L 的巰基乙醇的硼酸緩沖液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或PolyclarAT（除去酚類物質(zhì)毒害，防止顏色的干擾、少量石英砂在研缽中研磨。勻漿抽氣過(guò)濾，濾液10，000rpm離心15min，上清液為酶粗提液。上述操作均在0～4℃下進(jìn)行。
4. 活性測(cè)定與計(jì)算 1ml酶液加1ml0.02mol/L 苯丙氨酸，2ml蒸餾水，總體積為4ml。對(duì)照不加底物，多加1ml蒸餾水；反應(yīng)液置恒溫水浴30℃中保溫，0.5h后用紫外分光光度計(jì)在290nm處測(cè)定吸光度。以每小時(shí)在290nm處吸光度變化0.01所需酶量為一單位（相當(dāng)每毫升反應(yīng)混合物形成1μg肉桂酸）。蛋白質(zhì)含量用Folin－酚法進(jìn)行測(cè)定。