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士鋒生物化學(xué)誘變?nèi)旧w加倍及其鑒定
最近更新時(shí)間：2014-4-9
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>37KB
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一、目的
學(xué)習(xí)應(yīng)用秋水仙堿誘變園藝植物染色體加倍的操作技術(shù)，以及掌握染色體倍性鑒定的常用方法。
二、材料和設(shè)備
黃瓜種子以及幼苗；秋水仙堿、二甲基亞礬（DMSO）、聚乙二醇（PEG）；蒸餾水，小滴管，50ml量筒，100ml容量瓶，卷尺、放大鏡等。
三、說(shuō)明
應(yīng)用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生變異，進(jìn)行選擇育種的方法是化學(xué)誘變育種?；瘜W(xué)誘變育種分為兩類，一類是誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體，常用的試劑是秋水仙堿（Colchicine）；另一類是誘發(fā)基因突變或染色體斷裂，如甲基磺酸乙酯等烷化劑。前者的應(yīng)用較多、較廣泛。
秋水仙堿是從百合科植物秋水仙中提取出來(lái)的植物堿，極毒，易溶于冷水和酒精中。用于園藝植物誘變育種的秋水仙堿的有效濃為0.1%～1%，以0.2%zui有效。秋水仙堿誘變是通過阻斷紡錘體的正常形成，使染色體不能分離而導(dǎo)致加倍。由于有效誘變只發(fā)生在細(xì)胞分裂狀態(tài)活躍的細(xì)胞、組織，所以常用萌動(dòng)或萌發(fā)的種子、幼苗或生長(zhǎng)旺盛的莖尖作為誘變材料。二甲基亞礬（DMSO）具有改善細(xì)胞膜的透性，可以促進(jìn)植物對(duì)秋水仙的吸收；聚乙二醇（PEG）可以提高細(xì)胞的滲透壓，利于細(xì)胞吸收秋水仙，因此，它們常被用作秋水仙誘變的增效劑。
四、方法及步驟
1、藥劑配制
可以先用少量酒精溶解秋水仙粉劑，然后定容到所需的濃度；或直接用冷的蒸餾水配制。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度為0.2%和0.5%。秋水仙羊毛酯劑，不同濃度的秋水仙水溶液3～4，羊毛脂6，充分?jǐn)噭?，到看不見游離的水溶液為止。
2、誘變
①滴苗：在兩片真葉剛吐出（兩葉一心）時(shí)，分別用0.2%的秋水仙、0.2%秋水仙+1.5%DMSO、0.5%秋水仙、0.5%秋水仙+1.5%DMSO每天8：00和18：00滴生長(zhǎng)點(diǎn)。為了減少秋水仙滴落和蒸發(fā)，可用脫脂棉置于生長(zhǎng)點(diǎn)上，并在滴后遮蓋遮陽(yáng)網(wǎng)。連續(xù)處理5天。20天后，統(tǒng)計(jì)成活株和變異株。每種處理至少50株。
②浸種：用0.2%、0.5%、0.2%秋水仙+1.5%DMSO和0.5%秋水仙+1.5%DMSO的秋水仙堿分別浸漬（用濕紗布包裹種子）已經(jīng)催芽尚未露白的種子6hr、12hr和24hr。每種處理至少50株。然后播種在營(yíng)養(yǎng)缽中。1周后統(tǒng)計(jì)出苗株和變異株。
③四倍體的鑒定：在變異株中鑒定。本實(shí)驗(yàn)以間接鑒定為主，直接鑒定為輔。間接鑒定是與二倍體植株相比，同一基因型的四倍體特征如下：生長(zhǎng)緩慢；葉片肥厚、色深，葉片較寬或較大，有皺折；莖較粗壯，節(jié)間變短；花冠明顯增大，花色較重。在顯微鏡下觀察比較變異株和對(duì)照株的氣孔數(shù)目和大小，以及花粉粒的形態(tài)。四倍體植株的氣孔，通常數(shù)目變少，但氣孔變大；出現(xiàn)畸形花粉粒和4個(gè)萌發(fā)孔的花粉粒。果實(shí)結(jié)籽率低。直接鑒定是由1～2位同學(xué)利用卷須觀察體細(xì)胞染色體數(shù)目，確證是否是2n=28。
五、作業(yè)
1） 秋水仙處理獲得的變異株是否都是四倍體，為什么？
2） 影響秋水仙堿加倍染色體效果的因素有哪些？
3） 總體比較滴苗處理和浸種處理的誘變效果，并對(duì)結(jié)果予以解釋說(shuō)明。
表4-1 不同誘變效果的比較
處 理
處理株數(shù) 成活株、 成活率% 變異株、 變異率% 加倍株、 加倍率%
滴 苗
0.2%colchicine 0.2%C+1.5%DMSO 0.5%C 0.5%C+1.5%D Total - 浸 種 0.2%Colchicine 0.2%C+1.5%DMSO 0.5%C 0.5%C+1.5%D Total -