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士鋒生物醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量
最近更新時(shí)間：2014-5-14
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：37KB
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血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥緩沖液中，它們均電離成陰離子，在電場中向陰極泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶電荷多少及分子大小不同，所以在電場中的泳動(dòng)速度不同。一般所來，蛋白質(zhì)分子量小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快，分子量大而帶電荷少者泳動(dòng)速度慢，因此可以利用其泳速不同將之分開。
血清中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中的遷移速度不同（見下表）。
醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量
本實(shí)驗(yàn)用醋酸纖維素薄膜作為支持物進(jìn)行電泳，分離各種血清蛋白。正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶，從陽極到陰極依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。
醋酸纖維素素薄膜是由二乙酸纖維素加工制成，具有均一的泡沫結(jié)構(gòu)，厚度僅120mm。醋酸纖維素素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點(diǎn)：①電泳后區(qū)帶界限清晰；②通電時(shí)間較短（二十分鐘至一小時(shí)）；③它對各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎*不吸附，因此拖尾現(xiàn)象；④對染料也沒有吸附，因此不結(jié)合的染料能*洗掉，無樣品處幾乎完無色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素素薄膜水量較低，因此必需在密閉的容器中進(jìn)行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。
由于醋酸纖維素素薄膜作為支持物進(jìn)行蛋白電泳，具有以上優(yōu)點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)zui終采用此種方法分離血清蛋白質(zhì)并加以定量。
三、材料
（一）器材
醋酸纖維素薄膜（2×8cm），培養(yǎng)皿，點(diǎn)樣器，電泳儀，電泳槽，粗濾紙，鑷子
（二）材料
新鮮血清（未溶血）
（三）試劑
1、巴比妥緩沖液（pH 8.6，離子強(qiáng)度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥鈉12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，備用。
2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸餾水40ml，混勻。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml，混勻。
4、透明液：冰醋酸25ml，無水乙醇75ml，混勻。
四、方法
（一）準(zhǔn)備電泳槽
電泳槽內(nèi)放入巴比妥緩沖液。電泳槽應(yīng)密閉使蒸汽飽和，避免水分蒸發(fā)。將電泳槽與電泳儀接好。
（二）點(diǎn)樣
1、浸泡：用鑷子取醋酸纖維素薄膜『注1』1張（識別光澤面和無光澤面），無光澤面朝下小心平放在盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，浸泡30min左右（浸至無白斑）。
2．點(diǎn)樣『注2』：將浸透的薄膜從緩沖液取出（無光澤面朝上），用濾紙吸干多余的液體。點(diǎn)樣時(shí)，先在點(diǎn)樣器上均勻地沾上血清，在距陰1.5cm處將點(diǎn)樣器輕輕地印在薄膜上，使血清*滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線后迅速離開（見圖）。
醋酸纖維素素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）