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士鋒生物蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳
最近更新時間：2014-5-19
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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帶電顆粒在電場的作用下，向著與其相反的電極移動，稱為電泳。
電泳做為一種物質(zhì)分離及鑒定技術(shù)，其原理在于任一物質(zhì)質(zhì)點，由于其本身的解離作用或由于表面上吸附有其它帶電質(zhì)點，在電場中便會向一定的電極移動。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下，就會解離而帶電，帶電的性質(zhì)和多少取決于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)和溶液的pH值和離子強(qiáng)度。處于pI的蛋白質(zhì)分子所帶的電荷為零，在電場中不移動。若pH＜pI，蛋白質(zhì)分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動，pH＞pI的情況正好相反。
目前所采用的電泳方法大致可分為三類：顯微電泳，自由界面電泳及區(qū)帶電泳。以區(qū)帶電泳應(yīng)用比較廣泛，區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀，可以分為四大類：（1）濾紙電泳及薄膜電泳（如醋酸纖維素薄膜電泳）；（2）粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳等；（3）細(xì)絲電泳：如尼龍絲、人造絲電泳；（4）凝膠電泳：如聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳。
聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體（Acr）和少量的交聯(lián)劑N，Nˊ-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素）和加速劑（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交聯(lián)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。具有機(jī)械性能好、化學(xué)性能穩(wěn)定、靈敏度好、分辨率高的優(yōu)點。PAGE應(yīng)用十分廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量和少量制備，還可測定分子量和等電點等。
PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。前者電泳體系中緩沖液pH及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場中的泳動主要靠電荷和分子篩效應(yīng)；后者電泳體系中緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度是不連續(xù)的，帶電顆粒在電場中的泳動不僅主要靠電荷和分子篩效應(yīng)，還有濃縮效應(yīng)。
（1）凝膠對樣品分子的篩選效應(yīng)（分子篩效應(yīng)）
電場中，顆粒小、呈球形的樣品分子泳動速度快；顆粒大、形狀不規(guī)則的分子通過凝膠空洞時受到的阻力大，泳動慢。
（2）不連續(xù)系統(tǒng)對樣品的濃縮效應(yīng)
凝膠層的不連續(xù)性：不連續(xù)系統(tǒng)的凝膠包括濃縮膠和分離膠。濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中泳動時遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中泳動時遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。
緩沖液離子成分和pH的不連續(xù)性：在兩層凝膠中均有Tris和HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH。HCl在一定pH條件下易解離出Cl- ，它在電場中遷移率大，走在zui前面，故稱為快離子或前導(dǎo)離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH8.3的緩沖液中解離度很小，僅為0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。血清中，大多數(shù)蛋白質(zhì)pI在5.0左右，在pH8.3或6.7時均帶負(fù)電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介于快慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區(qū)帶。當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面，然后分離成多個區(qū)帶。
此外，電泳體系中電位梯度的不連續(xù)性對樣品的濃縮和遷移也具有一定作用。