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離子交換層析
最近更新時間：2014-5-20
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離子交換層析(Ion Exchange Chromatography 簡稱為IEC)是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1848年，Thompson 等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。
基本原理
是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。
其中R 代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，X-和X+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團(tuán)，Y+和Y-分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，A+和A-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A 離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于Y 離子，或者提高A 離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使A 離子將Y 離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動相，這就是的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹的基本分離過程。
陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。
各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個可逆的過程。結(jié)合的強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、溫度、溶劑組成等等。就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、pH 等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。離子交換劑的電荷基團(tuán)對不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講，離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大；價數(shù)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽離子交換劑對離子的結(jié)合力順序?yàn)?(Ion Exchange Chromatography ,IEC)。蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH 有較大關(guān)系。以用陽離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH 條件下，等電點(diǎn)pI < pH 的蛋白帶負(fù)電，不能與陽離子交換劑結(jié)合；等電點(diǎn)pI > pH 的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般pI 越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計，往往要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。
離子交換劑的種類和性質(zhì)
(1)離子交換劑的基質(zhì)
離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，聚苯乙烯離子交換劑(又稱為聚苯乙烯樹脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。聚苯乙烯離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素(Cellulose)、球狀纖維素(Sephacel)、葡聚
糖(Sephadex)、瓊脂糖(Sepharose)為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，葡聚糖離子交換劑一般以Sephadex G－25和G－50為基質(zhì)，瓊脂糖離子交換劑一般以Sepharose CL－6B 為基質(zhì)。關(guān)于這些離子交換劑的性質(zhì)可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹。
(2)離子交換劑的電荷基團(tuán)