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士鋒生物粘多糖－肝素鈉效價(jià)的測(cè)定
最近更新時(shí)間：2014-5-21
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肝素是一種粘多糖，其多肽鏈帶有許多陰離子基團(tuán)，如羧基、磺酸基等，使肝素具有強(qiáng)的負(fù)電荷性，能與陽(yáng)離子和帶正電荷的分子結(jié)合成復(fù)合物。肝素可以與Na+結(jié)合生成肝素鈉，具有抗血凝功能。其功能性效價(jià)的測(cè)定有兩種方法：生物鑒定法和天青A 比色法。本實(shí)驗(yàn)采用后一種方法對(duì)肝素鈉效價(jià)的測(cè)定。
堿性染料天青A 的正電荷與肝素磺酸基、羧基負(fù)電荷結(jié)合，生成肝素－天青復(fù)合物，其顏色不同于原來(lái)的顏色，在pH8.6條件下，于505nm 處可進(jìn)行比色測(cè)定。天青A 比色法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，適于粗制品的快速測(cè)定。
三、儀器和試劑
儀器
722型分光光度計(jì)、分析天平、pH 計(jì)、容量瓶、移液管、試管等。
試劑
1.巴比妥緩沖液：稱取4.12g 巴比妥鈉，加蒸餾水到500mL，再加19mL0.2mol/L 鹽酸，混勻后制成pH8.6的緩沖液。冰箱保存待用。
2.肝素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取一定量的肝素標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配成100單位/mL，冰箱保存。測(cè)定時(shí)，取2.5mL 稀釋到250mL，成為1單位/mL。
3.天青A 溶液：稱取0.5g 天青A，先用少量蒸餾水使其*溶解，再用水定溶到500mL，冰箱保存。臨用前取5mL，蒸餾水稀釋到25mL，混均，測(cè)定用。
四、操作步驟
(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取12支15mL 的試管，編號(hào)后按下表配比依次加樣并作平行管。
加完樣品、試劑后立即搖勻，于722分光光度計(jì)上測(cè)定A505，以0號(hào)管作空白對(duì)照。以肝素鈉效價(jià)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
粘多糖－肝素鈉效價(jià)的測(cè)定
(二)樣品測(cè)定
稱取10～15g 待測(cè)樣品，先用少量蒸餾水使其*溶解，再加水使成1mg/mL 溶液。取2.5mL，蒸餾水稀釋到250mL，混均，使成1mg/100mL 的測(cè)定液。吸取0.2～1.2mL 測(cè)定液，加水補(bǔ)足至2mL，依次加入巴比妥緩沖液2mL，天青A 溶液0.5mL，搖勻于722分光光度計(jì)上測(cè)定A505。
五、計(jì)算
從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相應(yīng)的效價(jià)，并按下式計(jì)算樣品的效價(jià)。
樣品的效價(jià) ＝ P1×V/V1×Sw
P1—待測(cè)樣品A505在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的效價(jià)單位數(shù)；
V—待測(cè)樣品總體積(mL)；
V1—測(cè)定時(shí)所用待測(cè)液體積(mL)；
Sw—待測(cè)樣品稱取量(mg)。