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士鋒生物具體層析方法：紙層析
最近更新時間：2014-5-23
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紙層析是分配層析法的一種，其以濾紙為惰性載體，展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。
濾紙纖維的—OH 基的親水基團可吸附有機溶劑中的水作固定相，有機溶劑作流動相，
當流動相沿濾紙自下向上展開，稱為上行層析；反之，流動相自上向下移動，為下行層析。
紙層析法主要依據(jù)混合組分對兩相分配系數(shù)的差異而進行分離的，同時也存在著某種程度的吸附作用和離子交換現(xiàn)象。
試樣經(jīng)層析后在濾紙上形成距原點不等的層析點，可用比移值(Rf)表示各組成成分的位置。
具體層析方法：紙層析
只要實驗條件不變，對于某一樣品成分Rf 值是一個常數(shù)，可用于定性分析。由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實驗條件下對照物質(zhì)對比以確定其異同。作為單體鑒別時，試樣所顯主色譜斑點的顏色(或熒光)與位置，應(yīng)與對照(標準)樣所顯主色的譜斑點或供試品-對照品(1∶1)混合所顯的主色譜斑點相同。作為質(zhì)量指標(純度)檢查時，可取一定量的試樣，經(jīng)展開后，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點的個數(shù)或呈色(或熒光)的強度。作為含量測定時，可將色譜斑點剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。
所用濾紙應(yīng)質(zhì)地均勻平整，具有一定機械強度，不含會影響色譜效果的雜質(zhì)，也不與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果。必要時可作特殊處理后再用。
(1)上行法
色譜缸一般為圓形或長方形玻璃缸，缸上有磨口玻璃蓋，以便密閉。色譜濾紙一般長約25cm，寬度則視需要而定，必要時可將色譜濾紙卷成筒形。點樣基線距底邊約2.5cm，可先用鉛筆畫出，再用微量吸管或微量注射器吸取溶劑，點于點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加后，使其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫熱氣流吹干。樣點直徑一般不超過0.5cm，樣點通常應(yīng)為圓形。色譜缸內(nèi)加入適量流動相，放置，待流動相蒸氣飽和后，將點樣后的色譜濾紙垂直浸入流動相約0.5cm，流動相即經(jīng)毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規(guī)定外，一般展開至15cm 后，取出晾干，按規(guī)定方法檢視。
色譜可以向一個方向進行，即單向色譜；也可進行雙向色譜，即先向一個方向展開，取出，待流動相*揮發(fā)后，將濾紙轉(zhuǎn)90°，再用原流動相或另一種流動相進行展。亦可多次展開，連續(xù)展或徑向色譜等。
(2)下行法
所用色譜缸同上行法。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動相的容器，槽內(nèi)有一玻璃棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂，避免流動相沿濾紙與溶劑槽之間發(fā)生虹吸現(xiàn)象。
取適當?shù)纳V濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當?shù)木嚯x(使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內(nèi)的流動相中，并使點樣基線能在溶劑槽側(cè)的玻璃支持棒下數(shù)厘米處)用鉛筆劃一點樣基線，必要時色譜紙下端可切成鋸齒形，以便于流動相滴下。將試樣溶于適當?shù)娜軇┲?，制成一定濃度的溶劑。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑，點于點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加后，使其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫熱氣流吹干。樣點直徑一般不超過0.5cm，樣點通常應(yīng)為圓形。將點樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內(nèi)，并用玻璃棒壓住，使色譜紙通過槽側(cè)玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數(shù)厘米處。色譜開始前，色譜缸內(nèi)用各單體中所規(guī)定的溶劑的蒸氣飽和，一般可在色譜缸底部放一裝有流動相的平皿，或?qū)⒔辛鲃酉嗟臑V紙條附著在色譜缸的內(nèi)壁上，放置一定時間，俟溶劑揮發(fā)使缸內(nèi)充滿飽和蒸氣。然后添加流動相，使浸沒溶劑槽內(nèi)濾紙，流動相即經(jīng)毛細管作用沿濾紙移動進行展開至規(guī)定距離后，取出濾紙，標明流動相前沿位置，待]流動相揮散后按規(guī)定方法檢出色譜斑點。