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士鋒生物辣根過氧化物酶的制備及酶比活力的測定
最近更新時間：2014-5-26
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過氧化物酶催化以下反應(yīng)：
2 H2O2 ─→ O2＋2H2O
這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(hemeProteins)。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。
辣根過氧化物酶(horserADIsh peroxidase，簡稱HRP，EC 1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。隨著酶標(biāo)技術(shù)的發(fā)展，作為標(biāo)記酶，辣根過氧化物酶的是目前使用zui普遍的一種酶，它的標(biāo)記物既能用于定位檢測，也能用于定量測定，因此分離制備辣根過氧化物酶很有實際意義。
本實驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，zui后制得高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶分子量在40，000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，等電點7.2；易溶于水，溶解度為5％(W/V)，溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH為7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下HRP在幾周內(nèi)保持穩(wěn)定，加熱到63℃后15分鐘內(nèi)穩(wěn)定。
辣根過氧化物酶氧化還原電勢很低，pH6.08時，E’0＝ -0.2070v；pH為7.71時，E’0＝ -0.5787v。
辣根過氧化物酶的作用機理可分以下幾步：
*步，形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物Ⅰ
第二步，復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物Ⅱ：
復(fù)合物Ⅰ＋AH──→復(fù)合物Ⅱ＋A (2)
第三步，復(fù)合物Ⅱ被還原，釋放出酶：
辣根過氧化物酶的制備及酶比活力的測定
AH：表示還原型氫供體。
在一定程度上復(fù)合物II可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物(P)，亦可與過量的過氧化氫形成無活性的復(fù)合物Ⅲ。
辣根過氧化物酶的活力測定方法有多種，主要原理介紹如下：
1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。
辣根過氧化物酶的制備及酶比活力的測定
403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收，結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測定時的酶濃度為1毫克蛋白／毫升。
2、愈創(chuàng)木酚法：測k4［見反應(yīng)式(3)］。以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基酚，guaiacol)為氫給體，其反應(yīng)如下：
四鄰甲氧基連酚