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士鋒生物發(fā)色底物測定大曲中α一葡萄糖苷酶活力
最近更新時(shí)間：2014-5-27
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酶活力是酶蛋白質(zhì)催化能力的一種定量表示，其活力單位目前大多都采用標(biāo)準(zhǔn)單位，亦即每分鐘催化形成一微摩爾產(chǎn)物或消耗一微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，通常用”U”表示。蛋白酶與無機(jī)催化劑不同，它的催化活力不僅與其自身有關(guān)，而且受反應(yīng)環(huán)境的影響，例如，產(chǎn)物抑制作用、反應(yīng)過程中的酶失活以及抑制因子的生成等，所以酶活力必須用初速度表示。但實(shí)際測定時(shí)考慮到產(chǎn)物濃度在一定時(shí)間內(nèi)與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系，一般就用產(chǎn)物在這段時(shí)間內(nèi)的變化量計(jì)算酶活力。
淀粉酶是糖苷水解酶中的一類，它的活力一般都用測定還原糖的辦法進(jìn)行分析。但由于淀粉酶的四種組分(淀粉-1，4-糊精酶、淀粉-l，4-麥芽糖酶、淀粉-1，6-糊精酶和α-葡萄糖苷酶)的水解產(chǎn)物都是還原糖，因此用還原糖法無法準(zhǔn)確測定單一酶活力。而發(fā)色底物法則可以克服這種困難，因?yàn)樗窃谔擒张浠下?lián)上一個(gè)發(fā)色基團(tuán)。比如，α-葡萄糖苷酶活力測定是采用對-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反應(yīng)底物；該底物是無色的。經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷鍵后可以釋放出對—硝基苯酚(pNP)，在堿性條件下是黃色的，因此可以通過測定410nm處的吸光度增加值計(jì)算酶活力。
三、儀器和試劑
實(shí)驗(yàn)原料：
大曲浸提液
儀器
分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、移液管(2mL)、試管、吸耳球等。
試劑
1. 對—硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)：1.25mM pNPG(75.2mg pNPG溶于200mL 50mM
醋酸緩沖溶液(pH5.6))。
2. 對一硝基苯酚(pNP)：4m mol/LpNP(111.3mg溶于200mL 50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6))。
3. 50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6)：16.4克NaAC加 12mL HAc并定容至 1000mL。
4. 1M碳酸鈉
四、操作步驟
(一)制作對—硝基苯酚(pNP)標(biāo)準(zhǔn)曲線
按下表分別取不同體積的對—硝基苯酚(4mM)，用50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6)稀釋成一系列濃度。然后在分光光度計(jì)上測定λ=410nm處的光密度，以濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)作曲線。
(二)α-葡萄糖苷酶活力測定
取 0.8mL對—硝基苯酚α-D-葡萄糖苷(pNPG)(1.25mM)，加入 0.2mL大曲浸提液，迅速混勻后于40℃水浴中保溫10分鐘，取出并立即加入2mL 1 M的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定λ=410nm處的光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于對—硝基苯酚的量，并計(jì)算酶活力。酶活力單位定義為：在上述分析條件下每分鐘催化形成一個(gè)微摩爾pNP所需要的酶量為一個(gè)活力單位。
五、計(jì)算
發(fā)色底物測定大曲中α一葡萄糖苷酶活力
V—酶液量mL；
n:—酶液稀釋倍數(shù)；
t—反應(yīng)時(shí)間(min)