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士鋒生物過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳
最近更新時(shí)間：2014-6-9
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1、電泳原理及影響電泳的主要因素
帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學(xué)研究中*的手段之一。
帶電離子在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度（1）和遷移率（泳動(dòng)度）（2）
V=
E·q·a
(1)
6πrη
u=
q·a
(2)
6πrη
由（2）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量q及解離度a的因素如pH的改變，都會(huì)對(duì)遷移率產(chǎn)生影響。因此，電泳應(yīng)盡可能在恒溫條件下進(jìn)行。并選用一定pH的緩沖液。同時(shí)，所選用的pH以能擴(kuò)大各種被分離物質(zhì)所帶電荷量的差異為好，以利于分離各種成分。遷移率與粒子的大?。╮）有關(guān)，非球形粒子（如DNA）在電泳過程中會(huì)受到更大的阻力，即粒子的移動(dòng)速度還與粒子形狀有關(guān)。
另外，遷移率還受電滲現(xiàn)象的影響。所謂電滲是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。例如在紙電泳中，由于濾紙（纖維素）上帶有負(fù)電荷，因感應(yīng)相吸而使與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷，從而使液體向負(fù)極移動(dòng)，帶動(dòng)著本來是向負(fù)極泳動(dòng)的物質(zhì)以更快的速度移動(dòng)。因此，電泳時(shí)應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場(chǎng)中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點(diǎn)，使得聚丙烯酰胺凝膠適合作區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)。
zui后，要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。一般低離子強(qiáng)度比較合適，因?yàn)榇藭r(shí)導(dǎo)電性低，產(chǎn)生的熱量較少。同時(shí)可使被分離的帶電離子對(duì)電流貢獻(xiàn)zui大從而加快電泳速度。但也不能過低，它必須可以緩沖被分離樣品中帶電離子對(duì)凝膠pH的影響，且過低的離子強(qiáng)度易導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝聚。一般zui適的離子強(qiáng)度在0.01～0.1mol/L之間。zui常見的為0.05。
在稀溶液中，離子強(qiáng)度Ⅰ可用下式計(jì)算：
Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)
（3)式中，mi為離子的摩爾濃度，Zi為離子的價(jià)數(shù)。
2、聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡(jiǎn)寫為Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，簡(jiǎn)寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。
Acr和Bis在它們單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，且具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)避免接觸皮膚。但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，它們聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基團(tuán)的方法有兩種，即化學(xué)法和光化學(xué)法。
化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，簡(jiǎn)寫為Ap），催化劑是N，N，N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡(jiǎn)寫為TEMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。冷卻可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長(zhǎng)，防礙聚合作用。這些因素在實(shí)際操作時(shí)都應(yīng)予以控制。
光聚合以光敏感物核黃素（即VB2）作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無色基，無色基被氧再氧化成自由基，從而引起聚合作用。
聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈的縱橫交錯(cuò)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩性質(zhì)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有良好的抗對(duì)流作用。此外，長(zhǎng)鏈上富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠。
聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。每100ml凝膠溶液中含有的單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T％表示。凝膠溶液中，交聯(lián)劑（Bis）占單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，用C％表示。改變凝膠濃度以便適應(yīng)各種樣品的分離。一般常用7.5％濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，而用2.4%的分離核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸分子量不同，適用的濃度也不同（見表1）。
表1 凝 膠 濃 度選 用 表
物 質(zhì)
分 子 量 范 圍
適用的凝膠濃度(%)
蛋 白 質(zhì)
＜104
20～30
1×104～4×104
15～20
4×104～1×105
10～15
1×105～5×105
5～10
＞5×105
2～5
核 酸
＜104
15～20
104～105
5～10
105～2×106
2～2.6