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等溫滴定微量熱技術(shù)在抗體性質(zhì)研究以及質(zhì)量控制中的應(yīng)用
最近更新時(shí)間：2014-6-17
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抗體和抗體產(chǎn)品在很多商業(yè)化產(chǎn)品中扮演了重要角色，如生物醫(yī)藥、診斷試劑盒以及色譜介質(zhì)等。這些產(chǎn)品的質(zhì)量控制對(duì)生物醫(yī)藥企業(yè)以及診斷試劑公司來說是至關(guān)重要的。通常用于檢測(cè)抗體產(chǎn)品質(zhì)量的方法有電泳和色譜法，它們能提供結(jié)構(gòu)信息但不能提供結(jié)合活性的信息。例如無法給出不同批次間抗體產(chǎn)品活力的差別。等溫滴定微量熱技術(shù)(ITC)提供了一種非常簡單而且準(zhǔn)確的方法用于抗體的質(zhì)量控制以及抗體和抗體產(chǎn)品的性質(zhì)分析。ITC可以快速有效地測(cè)定多種參數(shù)，例如抗體親和力(Ka)、抗原結(jié)合熱(ΔH)以及抗原抗體的結(jié)合比（n）?？贵w結(jié)構(gòu)上的改變(例如片段化、部分變性以及偶聯(lián)修飾)都會(huì)影響抗體的結(jié)合性能。另外，結(jié)合熱可以用來指示抗原抗體在體內(nèi)和體外的相互作用。
等溫滴定微量熱技術(shù)在抗體性質(zhì)研究以及質(zhì)量控制中的應(yīng)用
圖1 典型的ITC抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
上半部分表示每次注射采集的數(shù)據(jù)。下半部分表示每次注射的釋放的熱量（上圖中每個(gè)峰的面積積分）對(duì)滴定抗原與樣品池中抗體的摩爾比作圖
在ITC實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)配體（如受體、抗體）分子在恒溫條件下滴定到另一個(gè)相互作用分子的溶液中，結(jié)合釋放的熱（ΔH）被實(shí)時(shí)記錄下來。連續(xù)進(jìn)行多次滴定，分子結(jié)合釋放或吸收的熱直接正比于結(jié)合的分子數(shù)量。當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到飽和的時(shí)候，只能觀察到稀釋熱。將每次滴定產(chǎn)生的熱效應(yīng)與滴定和被滴定分子的摩爾比作圖，可以得到一條結(jié)合曲線（圖1）。MicroCal ITC能自動(dòng)完成滴定、數(shù)據(jù)采集和分析，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程非常簡單。ITC進(jìn)行一次滴定通常不到一小時(shí)即可完成。在這份應(yīng)用指南中，等溫滴定微量熱技術(shù)在抗體性質(zhì)研究以及質(zhì)量控制中的應(yīng)用ITC被用于奎納定抗體和茶堿抗體與各自抗原結(jié)合的活力和親和力測(cè)定。也被用于證明共價(jià)耦聯(lián)奎納定抗體對(duì)其活性有不利的影響。這種方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性通過茶堿抗體與抗原的結(jié)合試驗(yàn)得到證實(shí)。
確定活性抗體的濃度
茶堿是一種低分子量的支氣管擴(kuò)張劑，被用于治療哮喘（圖2）。它的其它醫(yī)學(xué)用途包括作為利尿劑和強(qiáng)心劑?？贵w通常用于診斷試劑盒中。制備出好的試劑盒，知道所用抗體的活性非常關(guān)鍵。我們證實(shí)ITC可以在較寬的濃度范圍內(nèi)確定溶液中活性抗體的濃度。利用ITC測(cè)定了茶堿與五種不同濃度抗體IgG的結(jié)合。如圖3，活性分子的濃度對(duì)根據(jù)280nm吸光值得到的總蛋白濃度作圖。
等溫滴定微量熱技術(shù)在抗體性質(zhì)研究以及質(zhì)量控制中的應(yīng)用
圖3 兩種方法測(cè)得抗體濃度比較
實(shí)驗(yàn)在30℃進(jìn)行，樣品池的體積是1.3ml?？共鑹AIgG抗體配成五種不同濃度，從0.8mg/ml到1.2mg/ml，蛋白濃度通過OD280吸收確定。所有滴定實(shí)驗(yàn)過程中，注射器中茶堿的濃度均為160μM。每次滴定實(shí)驗(yàn)共滴18次，每次滴10μl，每兩次滴定間隔3.5min。將ITC測(cè)得的抗體活性濃度對(duì)總蛋白濃度作圖，并進(jìn)行線性擬合。