士鋒生物耐熱DNA聚合酶常見的問題

最近更新時(shí)間：2014-7-8

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相關(guān)產(chǎn)品：

在不斷尋找新酶的基礎(chǔ)上，NEB還致力于對(duì)原有酶的修飾和改造，VentR(exo-)和 Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基礎(chǔ)上，去除其3"→5"的外切酶活性，使其更適用于雙脫氧法測(cè)序和率的PCR。雖然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低，但仍是Taq DNA聚合酶的2倍。

如何應(yīng)用DNA聚合酶合成4-15 kb的PCR產(chǎn)物?

使用正確的酶量。使用具有校讀功能的VentR DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)用量少，效果會(huì)更好。使用不具有校讀功能的VentR(exo-)或Deep VentR(exo-)DNA聚合酶時(shí)，每100 μl反應(yīng)體系中，用2-4個(gè)單位的酶量。如果反應(yīng)體系縮小，相應(yīng)調(diào)整酶量。

采用正確的引物延伸時(shí)間，按每延伸1 kb需要1分鐘來計(jì)算。當(dāng)使用具有校讀功能的DNA聚合酶時(shí)，延伸反應(yīng)時(shí)間不要超過計(jì)算時(shí)間的20%。使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶時(shí)，請(qǐng)分別嘗試2、4和6 mM的MgSO4濃度。

為什么PCR反應(yīng)后，沒有產(chǎn)物或條帶模糊?

檢查Mg2+濃度、聚合酶用量及延伸反應(yīng)時(shí)間。嘗試不同退火溫度及Mg2+的濃度。用酚/氯仿抽提及酒精沉淀法純化DNA。避免高鹽帶入PCR反應(yīng)體系中。確保dNTP沒有被水解。某些助溶劑如：100 μg/ml BSA，1-10%甲酰胺(formamide)或1-10%DMSO有助于一些引物和模板的結(jié)合。

什么原因可以造成沒有加入模板的陰性對(duì)照出現(xiàn)模糊條帶?

一旦某些Km值較低的DNA聚合酶(特別是具有校讀功能的聚合酶)不能有效地結(jié)合到引物的3"末端，可使引物形成一種特殊結(jié)構(gòu)(primer artifact)。這種結(jié)構(gòu)含有單鏈和雙鏈的區(qū)域，形成引物單鏈或雙鏈的多聚體，很難遷移出上樣孔，或自上樣孔形成模糊條帶。如果出現(xiàn)這種情況，建議降低引物濃度，縮短反應(yīng)時(shí)間，或使用VentR(exo-)、Deep VentR(exo-)和Taq DNA聚合酶。

使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶，產(chǎn)生什么樣末端的DN片段?

具有校讀功能的DNA聚合酶(如VentR、Deep VentR和9oNm)產(chǎn)生95%的平末端。與Taq DNA聚合酶相似，不具有校讀功能的DNA聚合酶，如VentR(exo-)和Deep VentR(exo-)產(chǎn)生兩種末端，其中70%是平末端，30%是3"末端單個(gè)堿基突出的粘性末端。

我想克隆PCR產(chǎn)物，這個(gè)PCR產(chǎn)物是用VentR 或Deep VentR DNA聚合酶合成的，選用哪種克隆方法更好?

的方法是：用平末端克隆法將片段插入已去磷酸化的載體上，(或使用NEB平端克隆試劑盒 #E0103)。插入片段的5"末端應(yīng)磷酸化，除非在引物合成時(shí)，引物的5"末端已有磷酸基。

PCR產(chǎn)物是否能在PCR反應(yīng)體系中直接磷酸化?

不能，因?yàn)?/span>PCR反應(yīng)中的硫酸胺會(huì)抑制T4多聚核苷酸激酶活性?？刹捎媚z回收或G25離心柱法來純化DNA。在50 μl反應(yīng)體系，加入1×T4 Polynucleotide

Kinase Buffer、1 mM ATP 和 小于200 pmol的5"羥基末端的DNA，70°C溫育5分鐘，冰上冷卻后，再加入20個(gè)單位的T4多聚核苷酸激酶，37°C溫育30分鐘。

怎樣才能提高PCR產(chǎn)物平滑末端的連接效率?

載體應(yīng)該去磷酸化以降低自身環(huán)化，插入片段的5"末端應(yīng)具有磷酸基。其它提高連接效率的方法還有：降低ATP在連接反應(yīng)緩沖液中的濃度，增加插入片段與載體的比例或使用快速連接試劑盒(NEB #M2200)。另外，可使用平端克隆試劑盒(NEB #E0103)。

VentR或Deep VentR DNA聚合酶產(chǎn)生平滑末端，可是我要用的克隆試劑盒是針對(duì)3"末端單個(gè)腺嘌呤堿基突出的粘性末端而設(shè)計(jì)的，怎么辦?

用Taq DNA聚合酶處理PCR產(chǎn)物的平末端。首先用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，純化DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(隨Taq DNA聚合酶提供)，再加入1個(gè)單位的Taq DNA聚合酶和200 μM dATP，混勻，72°C溫育20分鐘。

能否用VentR或Deep VentR DNA聚合酶來處理Taq DNA聚合酶產(chǎn)物，得到平滑末端的PCR產(chǎn)物?

能。首先將Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，得到進(jìn)一步純化的DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(隨VentR或Deep VentR DNA聚合酶提供)，在100μl反應(yīng)體系中，加入1-2個(gè)單位的VentR或Deep VentR DNA聚合酶和200μM dNTP，混勻，72°C溫育20分鐘，產(chǎn)品即可產(chǎn)生平滑末端。

在不斷尋找新酶的基礎(chǔ)上，NEB還致力于對(duì)原有酶的修飾和改造，VentR(exo-)和 Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基礎(chǔ)上，去除其3"→5"的外切酶活性，使其更適用于雙脫氧法測(cè)序和率的PCR。雖然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低，但仍是Taq DNA聚合酶的2倍。

如何應(yīng)用DNA聚合酶合成4-15 kb的PCR產(chǎn)物?

使用正確的酶量。使用具有校讀功能的VentR DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)用量少，效果會(huì)更好。使用不具有校讀功能的VentR(exo-)或Deep VentR(exo-)DNA聚合酶時(shí)，每100 μl反應(yīng)體系中，用2-4個(gè)單位的酶量。如果反應(yīng)體系縮小，相應(yīng)調(diào)整酶量。

采用正確的引物延伸時(shí)間，按每延伸1 kb需要1分鐘來計(jì)算。當(dāng)使用具有校讀功能的DNA聚合酶時(shí)，延伸反應(yīng)時(shí)間不要超過計(jì)算時(shí)間的20%。使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶時(shí)，請(qǐng)分別嘗試2、4和6 mM的MgSO4濃度。

為什么PCR反應(yīng)后，沒有產(chǎn)物或條帶模糊?

檢查Mg2+濃度、聚合酶用量及延伸反應(yīng)時(shí)間。嘗試不同退火溫度及Mg2+的濃度。用酚/氯仿抽提及酒精沉淀法純化DNA。避免高鹽帶入PCR反應(yīng)體系中。確保dNTP沒有被水解。某些助溶劑如：100 μg/ml BSA，1-10%甲酰胺(formamide)或1-10%DMSO有助于一些引物和模板的結(jié)合。

什么原因可以造成沒有加入模板的陰性對(duì)照出現(xiàn)模糊條帶?

一旦某些Km值較低的DNA聚合酶(特別是具有校讀功能的聚合酶)不能有效地結(jié)合到引物的3"末端，可使引物形成一種特殊結(jié)構(gòu)(primer artifact)。這種結(jié)構(gòu)含有單鏈和雙鏈的區(qū)域，形成引物單鏈或雙鏈的多聚體，很難遷移出上樣孔，或自上樣孔形成模糊條帶。如果出現(xiàn)這種情況，建議降低引物濃度，縮短反應(yīng)時(shí)間，或使用VentR(exo-)、Deep VentR(exo-)和Taq DNA聚合酶。

使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶，產(chǎn)生什么樣末端的DN片段?

具有校讀功能的DNA聚合酶(如VentR、Deep VentR和9oNm)產(chǎn)生95%的平末端。與Taq DNA聚合酶相似，不具有校讀功能的DNA聚合酶，如VentR(exo-)和Deep VentR(exo-)產(chǎn)生兩種末端，其中70%是平末端，30%是3"末端單個(gè)堿基突出的粘性末端。

我想克隆PCR產(chǎn)物，這個(gè)PCR產(chǎn)物是用VentR 或Deep VentR DNA聚合酶合成的，選用哪種克隆方法更好?

的方法是：用平末端克隆法將片段插入已去磷酸化的載體上，(或使用NEB平端克隆試劑盒 #E0103)。插入片段的5"末端應(yīng)磷酸化，除非在引物合成時(shí)，引物的5"末端已有磷酸基。

PCR產(chǎn)物是否能在PCR反應(yīng)體系中直接磷酸化?

不能，因?yàn)?/span>PCR反應(yīng)中的硫酸胺會(huì)抑制T4多聚核苷酸激酶活性?？刹捎媚z回收或G25離心柱法來純化DNA。在50 μl反應(yīng)體系，加入1×T4 Polynucleotide

Kinase Buffer、1 mM ATP 和 小于200 pmol的5"羥基末端的DNA，70°C溫育5分鐘，冰上冷卻后，再加入20個(gè)單位的T4多聚核苷酸激酶，37°C溫育30分鐘。

怎樣才能提高PCR產(chǎn)物平滑末端的連接效率?

載體應(yīng)該去磷酸化以降低自身環(huán)化，插入片段的5"末端應(yīng)具有磷酸基。其它提高連接效率的方法還有：降低ATP在連接反應(yīng)緩沖液中的濃度，增加插入片段與載體的比例或使用快速連接試劑盒(NEB #M2200)。另外，可使用平端克隆試劑盒(NEB #E0103)。

VentR或Deep VentR DNA聚合酶產(chǎn)生平滑末端，可是我要用的克隆試劑盒是針對(duì)3"末端單個(gè)腺嘌呤堿基突出的粘性末端而設(shè)計(jì)的，怎么辦?

用Taq DNA聚合酶處理PCR產(chǎn)物的平末端。首先用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，純化DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(隨Taq DNA聚合酶提供)，再加入1個(gè)單位的Taq DNA聚合酶和200 μM dATP，混勻，72°C溫育20分鐘。

能否用VentR或Deep VentR DNA聚合酶來處理Taq DNA聚合酶產(chǎn)物，得到平滑末端的PCR產(chǎn)物?

能。首先將Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，得到進(jìn)一步純化的DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer(隨VentR或Deep VentR DNA聚合酶提供)，在100μl反應(yīng)體系中，加入1-2個(gè)單位的VentR或Deep VentR DNA聚合酶和200μM dNTP，混勻，72°C溫育20分鐘，產(chǎn)品即可產(chǎn)生平滑末端。

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