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士鋒生物DEAE離子交換吸附試驗
最近更新時間：2014-7-11
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(一) 原理
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點(diǎn)為PH6.85～7.5)，其余均屬酸性蛋白。在PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。
(二)試劑和器材
1、試劑:
(1)鹽析提取的人γ球蛋白;
(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10%NaN3;
(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG);
(4)0.1M, PH7.4 PB(配制見鹽析部分);
2、器材:
(1)層析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗(200目);
(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導(dǎo)儀、抽濾裝置(包括抽氣機(jī)、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶)，PH計;
(3)透析袋、座標(biāo)紙、濾紙、PH精密試紙;
(4)量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。
(三) 操作步驟
1、DEAE-Sephadex A-50預(yù)處理
稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至PH呈中性;再以0.5N HCl同上操作過程處理，zui后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中
2、裝柱
(1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。
(2)將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。
(3)關(guān)閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3、平衡:啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強(qiáng)度是否相同。達(dá)到一致時關(guān)閉出水口，停止平衡。
4、加樣及洗脫:
啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品(體積應(yīng)<床體積的2%，蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次;再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴/分鐘。
5. 收集：開始洗脫的同時就以試管進(jìn)行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6. 測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。
7. 合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG(MW6000)洗縮至所需體積，加入0.02%NaN3防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
8. A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達(dá)再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時，以*洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。
(四) 注意事項
1. 柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
2. 純化過程必須嚴(yán)格控制脫緩沖液的PH及離子強(qiáng)度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后，才能進(jìn)行柱層析。
3. 所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。
4. 洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，且勿過快。
5. 上樣的體積要小，濃度不宜過高。
6. 加樣及整個洗脫過程中，嚴(yán)防柱面變干。