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動物細胞培養(yǎng)及外源基因的導入實驗
最近更新時間：2014-8-11
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細胞培養(yǎng)是現代生物學研究中應用的技術之一。它的突出優(yōu)點，一是研究對象是活的細胞，可長時期地監(jiān)控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結構和生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學、生物等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質均一的細胞，需要時還可采用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經濟等優(yōu)點。
然而，細胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細胞脫離了機體復雜的環(huán)境條件，其細胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復傳代、長期培養(yǎng)的細胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應將體外培養(yǎng)的細胞視為一種既保持動物體內原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。
由于細胞培養(yǎng)技術的優(yōu)點是其他實驗方法和技術所不能比擬的，所以近年來細胞培養(yǎng)技術在分子生物學、細胞生物學、遺傳學、老年學、免疫學、腫瘤學和病毒學等很多領域都得到了廣泛的應用，其中對于分子生物學家及細胞生物學家而言，應用細胞培養(yǎng)對感興趣的基因產物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導入不同類型細胞，以分析其表達，測定表達對細胞生長的影響，或將高表達的基因產物純化。將外源DNA導入哺乳動物細胞有兩種途徑：穩(wěn)定（*）或暫時性轉染。穩(wěn)定轉染的目的是將轉移基因整合到細胞染色體DNA上，形成穩(wěn)定表達轉移基因的細胞系。一般需要共轉染一個選擇標記，用于追蹤轉染成功的細胞或轉染效率。暫時性轉染的目的是為了分析轉移基因的暫時轉錄或表達，一般在轉染后1-4天內進行。針對培養(yǎng)細胞的外源DNA導入已發(fā)展出多種技術，其中常用的有磷酸鈣介導的轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，脂質體介導的轉染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時性轉染和*性轉染。但它們有各自適用的細胞系。培養(yǎng)的細胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數量級的差異。因此針對細胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要。
Graham和Vander EB（1973）報告了用Ca3(PO4)2-DNA沉淀將腺病毒SV40導入哺乳動物細胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導入并在哺乳動物染色體上穩(wěn)定整合外源DNA。至今對于磷酸鈣介導的DNA轉染的確切機理仍不清楚。一般認為轉移DNA通過內吞作用進入細胞質，然后進入細胞核，而CaPO4處理被認為是產生了一種能促使DNA附著在細胞表面的環(huán)境。
細胞凋亡是細胞的一種基本生命現象，對于機體的組織發(fā)育、器官分化及多種病理過程均具有重要作用。細胞凋亡具有典型的形態(tài)學及生化特征。包括細胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一個強有力的生化指標是“DNA Ladder”的產生，由于凋亡相關的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細胞的總DNA可以在核小體間進行切割，提取總DNA進行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）。一般認為出現DNA Ladder 的細胞肯定發(fā)生了凋亡，但并非所有發(fā)生凋亡的細胞都會出現DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制，只有當凋亡細胞占到細胞總量的15%以上時，特異降解的DNA經過電泳才會較好地顯示DNA Ladder。