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液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度至長(zhǎng)出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè), 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率.在18度 150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒(méi)有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng), 放在冰水中冷卻10分鐘4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮, 添加zui終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.在液氮或-80度保存.
TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER
PIPES 3.0G 10mM
CaCl2.2H2O 2.2g 15mM
KCl 18.6g 250mM
add water up to 950ml
用 5N KOH 調(diào)PH至6.7-6.8*低PH不溶
在加終濃度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g
定溶到1升, 過(guò)濾滅菌, 4度保存.
但有人提出, 凍存后轉(zhuǎn)化效率降低, 且這種方法不適合大質(zhì)粒.
【zihudie】
（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養(yǎng)活化。
（2）挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18℃，200-250rpm培養(yǎng)。
（3）當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí)，用預(yù)冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（4）用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（5）重復(fù)第4步操作。
（6）用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中。
本法效率*,建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM------1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建議用TSS法，簡(jiǎn)單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用。
以下為轉(zhuǎn)貼，具體方法請(qǐng)查閱文獻(xiàn)。
E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法:
單菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 轉(zhuǎn)至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
離心后用10毫升TSS重懸后,分裝 -70oC保存。盡量冰上操作.
轉(zhuǎn)化: 加質(zhì)粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分鐘，42oC 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml
, 37oC 1小時(shí)后鋪抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O