士鋒生物如何進(jìn)行細(xì)胞凍存及細(xì)胞復(fù)蘇

最近更新時(shí)間：2014-9-18

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冷凍保存方法 
按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-700C～-800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存zui常用的仍是前一種方法。

一、非玻璃化凍存方法
下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過程。

主要材料
1.  儀器設(shè)備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C～-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等；

2.  凍存管：容量為1ml或1.5ml；

3.  冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；

4.  待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。

操作過程
1.  待凍存細(xì)胞懸液的制備
(1)按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；
(2)將細(xì)胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜；
(3)向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml；
(4)按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；
(5)再凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。

2.  分級(jí)冷凍
(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min；
(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C～-200C），約30～60min；
(3)將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C），放置30min左右；
(4)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C～-800C），；
(5)zui后將凍存管投入液氮保存。

3.  記錄
做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。

凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。

討論
在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)帶手套。

在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。操作過程中帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。

應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。

凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37～400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。

二、玻璃化凍存方法
以下以人單核細(xì)胞為例說明這種細(xì)胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）。

主要材料
1.  冷凍保護(hù)液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.  凍存管：SILASTIC玻璃小管，內(nèi)徑3mm，外徑4.5mm；

3.  設(shè)備：液氮儲(chǔ)存罐；

4.  待凍存細(xì)胞：人類外周血單核細(xì)胞。

凍存過程
1.  用常規(guī)方法分離全血中單核細(xì)胞；

2.  在冰浴中預(yù)冷冷凍保護(hù)液；

3.  將裝有單核細(xì)胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)（冰?。?；

4.  沿離心管壁緩慢滴加預(yù)冷的冷凍保護(hù)液。滴加過程為：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的凍存液以0.75ml/min速度滴加。2×107個(gè)細(xì)胞要滴加15ml凍存液。滴加的時(shí)間在15min左右。zui終細(xì)胞密度要在1×106～1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml，邊滴加邊輕輕晃動(dòng)離心管；

5.  輕輕吹吸混勻細(xì)胞冷凍懸液；

6.  將細(xì)胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm長(zhǎng)的凍存管裝0.8ml細(xì)胞冷凍懸液；

7.  將凍存管兩端以火焰封口；

8.  zui后將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為6000C/min。

凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。

討論
玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。

因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對(duì)細(xì)胞具有毒性（但在40C時(shí)毒性大為減弱）。所以，冷凍保護(hù)液的滴加全過程必須在40C冰浴中進(jìn)行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
一、非玻璃化凍存的復(fù)蘇方法

主要材料
1.  儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機(jī)；

2.  培養(yǎng)用液：*培養(yǎng)液。

復(fù)蘇過程
1.  調(diào)配370C～400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C～400C；

2.  從液氮中取出凍存管，立即投入370C～400C 溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液*溶解；

3.  將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；

4.  將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜；

5.  向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入*培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。

討論
細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識(shí)，避免被液氮凍傷。

二、玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
以下以人的單核細(xì)胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。

主要材料
1.  設(shè)備：高速離心機(jī)；

2.  培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。

操作過程
1.  將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約5600C/min。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇；

2.  將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中；

3.  沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min 以0.5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入，zui后30min以1ml/min的速度加入。全過程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行；

4.  將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用于培養(yǎng)。

結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。

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