大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)

最近更新時間：2014-10-22

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.材料與方法

1.1 鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

1.1.1 鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞的分離 取10～12只1～5d的Wistar大鼠（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供），雌雄兼用，于超凈工作臺上操作者左手拇食二指持乳鼠頸部稍下處，常規(guī)消毒頭皮后，右手持眼科剪沿正中線剪開頭皮與顱骨，用眼科彎鑷取出鼠腦。取出的腦立即放入盛有冰冷Hank's液的平皿中。去除大血管、軟腦膜、腦干、小腦和大腦髓質(zhì)。將收集到的大腦皮質(zhì)，轉(zhuǎn)入另一先放有170μm不銹鋼篩網(wǎng)的冰冷Hank's液的平皿中，用玻璃吸管反復吹打呈腦勻漿，棄濾液，再用Hank's液反復沖洗網(wǎng)上的血管，將收集的血管段液再經(jīng)孔徑75μm尼龍網(wǎng)過濾，500轉(zhuǎn)離心3min，棄上清，收集沉淀的血管段。

1.1.2 原代微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 將 微血管段移入0.1‰的Ⅶ膠原酶中37℃振蕩消化20min，800r/min離心3min，棄上清，沉淀物加入含15%胎牛血清的M199（*培養(yǎng)液）制成細胞懸液，接種于35ml 塑料培養(yǎng)瓶(Nunclon)中（瓶底朝上），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，2h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（瓶底朝下），1d后換全液，以剔除混雜的非內(nèi)皮細胞，以后每3d換*培養(yǎng)液1次進行細胞原代培養(yǎng)。

1.1.3 細胞傳代培養(yǎng) 細胞原代培養(yǎng)7～9d后，細胞呈單層密集生長近亞融合時進行傳代繁殖，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化細胞，見細胞大部分脫落時加入*培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打,制成細胞懸液,按實驗需要傳代,傳代時接種密度為3×104 /ml。

1.2 特性鑒定

1.2.1 形態(tài)學 用Olympus倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞的形態(tài)及生長規(guī)律。

1.2.2 用MTT法測內(nèi)皮細胞的生長率 傳代培養(yǎng)至第3代，接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度為3×104/ml，在1～11d 內(nèi)，每天收集3孔的細胞進行MTT法測細胞的活力。即細胞培養(yǎng)至所選時間，棄上清，每孔加入400μl M199，40μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心2000轉(zhuǎn)，5min，棄上清，每孔加入400μl二甲基亞砜溶解紫色結晶，再轉(zhuǎn)入96孔板，于自動酶標儀上測定OD570 值，吸光度值的大小反映內(nèi)皮細胞成活數(shù)量及活性。

1.2.3 免疫組化 將長有細胞的蓋玻片取出，用濃度為0.1 mmol/L PBS漂洗后，4℃丙酮固定10min，滴加Ⅷ因子相關抗原的抗體(博士德，即用型)，再按通用型SP kit (北京中山)說明進行操作，DAB顯色，封片后鏡下觀察和照相。

2.結 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡觀察分離的微血管段形態(tài)各異，長短不等，呈單枝或多枝狀。經(jīng)膠原酶消化后，微血管管壁不清，壁上內(nèi)皮細胞清晰可見。2h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，目的是去除首先貼壁的長梭形成纖維細胞。混懸液內(nèi)還有未分離干凈的神經(jīng)組織碎片和紅細胞，1d后換全液即可清除，換液后可見大部分微血管片段已貼壁，邊緣長出單個內(nèi)皮細胞，呈三角形或長梭形，排列不規(guī)則，核淡，胞膜明顯，2～3d可見細胞分裂增殖形成散在細胞群落，7～9d融合成片狀，細胞緊密排列，互不重疊，呈典型的鋪路卵石樣結構(見圖1)。傳代細胞初種時為明亮的園球形，懸浮于培養(yǎng)液中，4h后大部分細胞貼壁，呈扁平狀，24h后細胞胞體變大，隨培養(yǎng)時間延長，細胞多呈三角形或長梭形，7d后細胞增殖成單層片狀。傳至第4代時細胞輪廓欠清。測定第三代內(nèi)皮細胞的生長率表明內(nèi)皮細胞的生長高峰在7～9d 以后不再增殖，出現(xiàn)生長接觸抑制現(xiàn)象。

2.2 免疫組化

原代、第三代內(nèi)皮細胞進行ⅧF：Ag免疫組化檢查，95%以上細胞的胞漿和核膜周圍被染成棕褐色，證實培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞為血管內(nèi)皮細胞。

3.討 論

血管內(nèi)皮遍布全身，位于整個循環(huán)系統(tǒng)的內(nèi)表面，它不僅是血管的被動襯里，而且是肌體zui大的內(nèi)分泌腺[2]。由于它所處的特殊位置，可通過不同的機制和生化信息，來釋放血管活性物質(zhì)、細胞因子和生長因子，以調(diào)節(jié)免疫反應、血液流動性、凝血過程、血管床張力及通透性，參與正常和新生組織的血管形成。腦微血管內(nèi)皮細胞是位于毛細血管微循環(huán)的一種特殊細胞，具有極其重要的功能。它是構成血腦屏障的主要成分，同時與腦水腫、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、腦腫瘤的浸潤和擴散，尤其是腦腫瘤的血管形成等病理過程緊密相關。我們對鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的償試，為體外研究各種顱腦疾病提供一種嶄新的實驗工具。由于不同來源的血管內(nèi)皮細胞之間存在較大的差異性，人們常根據(jù)不同的研究目的選取不同的血管內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng)。國外對腦微血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)始于70年代末，難點主要在于腦微血管分離步驟繁雜、內(nèi)皮細胞難以純化，建立與維持微血管內(nèi)皮細胞很難，且有些方法不適合于國內(nèi)普通實驗室，如需要高速冷凍離心機和價格昂貴的內(nèi)皮細胞生長因子等 [3]，故國內(nèi)關于腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法的報道較少。我們根據(jù)本校條件，探討了培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法，成功進行了Wistar 乳鼠大腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)。根據(jù)我們的體會，培養(yǎng)時應注意以下幾點：(1)仔細剝離軟腦膜，去除腦干、大血管、小腦和大腦髓質(zhì)后，吹打成勻漿的腦組織經(jīng)過 170μm和75μm兩種孔徑濾網(wǎng)過濾，這樣既可去除較大組織塊和大血管，又可達到收集微血管段的目的，因據(jù)Brendel等[4]研究發(fā)現(xiàn)鼠腦微血管的直徑在6～80μm之間，分離腦微血管多選直徑80μm左右的濾網(wǎng)篩選。(2)膠原酶充分消化。我們用0.1‰的Ⅶ膠原酶在37℃恒溫搖床振蕩消化20min即可。酶充分消化有助于內(nèi)皮細胞的遷移、去除周皮細胞。消化時間的長短因膠原酶的類型與不同的濃度而有所不同。(3)原代培養(yǎng)時需收集到足夠量的微血管，否則培養(yǎng)難以成功。(4) 原代培養(yǎng)2h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶以去除先貼壁的成纖維細胞，24h后換液一次以去除未貼壁的雜質(zhì)，凈化培養(yǎng)環(huán)境。開始培養(yǎng)的2～5d，在倒置顯微鏡下用機械方法(細胞刮刀)刮去可疑的細胞或細胞群落。(5)傳代培養(yǎng)時，只收集zui先脫落的細胞進行培養(yǎng)，這是因為內(nèi)皮細胞具有貼壁早，而在酶消化時易脫落的特性[5]。(6)培養(yǎng)內(nèi)皮細胞選用含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)液來培養(yǎng)，這樣有利于內(nèi)皮細胞的生長、逐漸淘汰混雜的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。

參 考 文 獻

[1] Chi OZ, Wei NM, Sinha AK, et al. Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia[J]. Pharmacology,1994;48:367-373.

[2] Inagami T, Naruse M, Richard H. Endothelium as an endocrine organ[J]. Annu Rev Physiol,1995;57:171-189.

[3] Gordon EL, Danielsson PE, Hguyen TS, et al. A comparision of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol,1991;27A:312-326.

[4] Brendel K, Meezan E, Carlson EC. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex[J]. Science, 1974;185:953-955.

[5] Browman PD, Betz AL, Diane AR,et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain[J]. In Vitro,1981;17(4):253-262.

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