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分離肺泡上皮細(xì)胞的步驟
最近更新時(shí)間：2014-11-3
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一、取得*無血液殘留的肺臟：
實(shí)驗(yàn)前j將大鼠全身血液放凈，取得*無血液殘留的肺臟
二、消化肺組織：
常用于細(xì)胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是zui早用于消化、分離上皮細(xì)胞的酶，現(xiàn)在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩(wěn)定，有效作用時(shí)間短暫，容易自我降解等問題。Dobbs L G等認(rèn)為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細(xì)胞[9]。胰蛋白酶消化沒有選擇性，會(huì)帶來像內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質(zhì)細(xì)胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細(xì)胞的純度和產(chǎn)量。與此相反，Cunningham A C等發(fā)現(xiàn)，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產(chǎn)量的Ⅱ型上皮細(xì)胞[10]。膠原酶可以用來輔助消化細(xì)胞間質(zhì)。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒有文獻(xiàn)定量描述*化的酶消化方法。Finkelstein J N等發(fā)現(xiàn)可以通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。
三、分離純化細(xì)胞：
上皮細(xì)胞的分離純化技術(shù)經(jīng)過二三十年的發(fā)展日漸成熟，呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。目前對(duì)細(xì)胞的分離純化主要有以下幾種方法。
1、密度梯度離心：
密度梯度離心分離細(xì)胞的原理是不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。這是zui早用于分離Ⅱ型上皮細(xì)胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心，豬肺泡Ⅱ型細(xì)胞zui終純度可以達(dá)到70%～85%左右[11-12]。沉降系數(shù)與細(xì)胞的直徑和天然密度有關(guān)。由于Ⅱ型細(xì)胞與其他細(xì)胞存在密度和大小的交叉(如巨噬細(xì)胞)，僅僅通過離心并不能有效去除雜細(xì)胞。Kikkawa(1974)讓巨噬細(xì)胞吞噬一些重顆粒(如硫酸鋇)，改變其密度，可以幫助區(qū)分巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。離心后的純度達(dá)到94%,但產(chǎn)量明顯減少[8]。上皮細(xì)胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細(xì)胞重疊的細(xì)胞層，這必然會(huì)造成某些密度大的Ⅱ型細(xì)胞損失，產(chǎn)量大大降低。
2、濾膜分離：
濾膜分離的原理是根據(jù)細(xì)胞的大小不同來進(jìn)行分離。Ⅱ型上皮細(xì)胞約10μm，比巨噬細(xì)胞(約25μm)和Ⅰ型細(xì)胞(50μm-100μm)小，用150μm孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30μm-40μm孔徑的濾膜除去全部Ⅱ型細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞[13]，采用15μm的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡(jiǎn)單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。
3、流式細(xì)胞技術(shù)：
流式細(xì)胞技術(shù)分離的原理是根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異。根據(jù)不同種細(xì)胞的特征識(shí)別，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮細(xì)胞的單抗進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選，得到96%的Ⅱ型上皮細(xì)胞[14]。但熒光素對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞有害。Rochat T R等發(fā)現(xiàn)自然熒光和直角光散射可以區(qū)分巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，這給不經(jīng)熒光標(biāo)記分離上皮細(xì)胞提供了可能[15]。流式技術(shù)分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度*。這種技術(shù)經(jīng)過完善在將來會(huì)更有吸引力。
4、免疫黏附：
免疫黏附的原理是各種細(xì)胞的膜表面有不同的免疫活性物質(zhì)。巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細(xì)胞懸液置于板上，巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞因?yàn)楹蠪c片段的受體而與IgG結(jié)合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型細(xì)胞被沖洗下來[16]。經(jīng)過多年的摸索，這種方法近幾年已開始應(yīng)用，簡(jiǎn)便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，有效的提高上皮細(xì)胞的純度。
5、貼壁選擇：
貼壁選擇的原理是各種細(xì)胞完成貼壁的時(shí)間不同，這種特性用在培養(yǎng)時(shí)做篩選。根據(jù)zui終目的，綜合其中幾種方法能達(dá)到較好的效果。例如先用濾膜過濾，再用IgG包被法。