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大鼠心肌細胞分離
最近更新時間:2014-11-5
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大鼠心肌細胞比乳鼠心肌難養(yǎng),用無血清培養(yǎng)基,呈桿狀,橫紋清楚,在培養(yǎng)基里細胞不搏動。
大鼠心肌細胞分離一般是采用二型膠原酶分離,濃度為1mg/ml(用無鈣臺氏液配制),同時酶液里加入?;撬?,BSA。一般采用Langendorff灌流的方法,大鼠開胸后,迅速取出心臟,放入冰的臺氏液中,找到主動脈后,掛上Langendorff裝置,衡流泵灌入無鈣臺氏液(37度),開始心臟會搏動幾下,這樣把心臟中的淤血擠出(此處也有人用有鈣臺氏液灌流,好讓心臟充分搏動,把淤血擠出,不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時間短,一般搏動幾下就能把淤血清楚干凈了)。幾分鐘后,換酶液開始灌流心臟,一般開始時,心臟較軟,待消化一段時間后變硬,繼續(xù)消化后又變軟,且心臟發(fā)白,這時候就可以停止消化,將心室剪下,放入KB液中,用剪刀剪碎后,用滴管吹打,取上清,繼續(xù)加入KB液,吹打,直到上清液不渾濁為止,一般吹打3-4次即可。將各次上清合并,吹打過濾后,沉降20分鐘左右,棄上清,加入無血清培養(yǎng)基(MEM,不含L-谷氨酰胺,并加入肌酸,?;撬幔珺SA,肉毒堿,HEPES),吹打,1000轉/分離心半分鐘,棄上清,再洗1-2次后,將沉淀加入到6%的BSA中沉降15-20分鐘(純化心肌細胞),然后計數(shù),點板或培養(yǎng)。
此法中如果各步注意無菌操作,zui后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,再換正常培養(yǎng)基,可適用于條件不是很好的試驗室。如果能在板或瓶內(nèi)加入Laminin處理后,貼壁很好。如果分離出來的心肌細胞,逐級復鈣后培養(yǎng),狀態(tài)更好。*狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上。