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大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)
最近更新時間：2014-11-10
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
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材料與方法：
材料 :
培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、燒瓶、試管，玻璃針等。
眼科剪、眼科鑷、手術(shù)刀片。
5%CO2孵箱、PH計。
恒溫水浴箱。
PMi1640培養(yǎng)基，D-Hank’s緩沖液 、胎牛血清，內(nèi)皮生長因子（ECGF），青霉素，鏈霉素,戊巴比妥鈉等。
方法：
1、取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大劑量2%戊巴比妥鈉麻醉處死，將處死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超凈臺。在無菌狀態(tài)下剪開胸腹腔，分離胸主動脈,用2ｍｌ注射器從主動脈弓處向胸主動脈注入D-Hank’s液,驅(qū)除殘血,取主動脈弓至腎動脈一段，兩端結(jié)扎剪斷，放入60℃預(yù)熱無菌水中2秒。然后置于準備好的RPMi1640培養(yǎng)基（含雙抗）中。
2、剪切：在超凈臺上，將血管置于培養(yǎng)皿中,用眼科鑷小心剝離外膜面的結(jié)締組織,并從根部剪去所有肋間動脈。無血清培養(yǎng)基沖洗數(shù)遍,去除殘血后,將動脈轉(zhuǎn)移至另一含少量培基的無菌培養(yǎng)皿中，用刀片將主動脈兩末端切去,剩下的主動脈切成寬1～1.5ｍｍ的環(huán)。
3、接種：將動脈環(huán)豎直放入35ｍｍ培養(yǎng)皿(1%明膠4℃預(yù)置,用前2ｈ移入ＣＯ2培養(yǎng)箱,用前培養(yǎng)液沖洗)中。置ＣＯ2培養(yǎng)箱2ｈ后,加入1.5ｍl培養(yǎng)基。放入37℃,5%ＣＯ2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72ｈ后細胞從環(huán)內(nèi)外生長遷出,環(huán)內(nèi)為內(nèi)皮細胞,環(huán)外為成纖維細胞。將動脈環(huán)除去后,可看到內(nèi)膜面細胞集落與外膜面之間有明顯的無細胞區(qū)界限，用玻璃針剔除成纖維細胞,得到純的內(nèi)皮細胞生長克隆。繼續(xù)培養(yǎng)10～15ｄ，此時FBS濃度為２０％,形成細胞單層。
4、置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液，培養(yǎng)時添加15% FBS，5～10μg/ml的內(nèi)皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待細胞90%~95%融合時，0.25胰蛋白酶消化傳代。
5、內(nèi)皮細胞鑒定：相差顯微鏡下,細胞呈單層鋪路石狀;免疫組化證明有vWF相關(guān)抗原存在。
6、注意事項:將分離出來的主動脈熱處理時溫度以60℃2秒為宜,太低則成纖維細胞多,太高或時間久則內(nèi)皮細胞遷出減少。