QQ交談
您所在位置：請輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://true-witness.com/st236594/
外源基因在真核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)
最近更新時(shí)間：2014-11-14
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：601次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：1244次
一、生化方法
1、磷酸鈣介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
（1）轉(zhuǎn)染前24 h，通過胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基以1×105至4×105細(xì)胞/cm2的密度平鋪細(xì)胞于60 mm組織培養(yǎng)皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20～24 h。轉(zhuǎn)染前1 h換液。
（2）按照下屬方法制備磷酸鈣-DNA沉淀：于5 ml滅菌塑料管內(nèi)混合100μl 2.5 mol/L CaCl2與25μg質(zhì)粒DNA，如有必要用0.1×TE（pH7.6）將體積補(bǔ)至1 ml。室溫下將以上2×鈣-DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合。迅速彈敲試管側(cè)壁混勻溶液，靜置1 min。
（3）立即將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中。每1 ml培養(yǎng)基加0.1 ml懸液。輕輕搖動(dòng)平皿混勻培養(yǎng)基，培養(yǎng)基會變成混濁的橘黃色。一旦形成DNA沉淀，轉(zhuǎn)染效率會大大降低，因此此步動(dòng)作應(yīng)盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與/或丁酸鈉處理細(xì)胞，直接進(jìn)行步驟5。
（4）如果轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不用轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑處理，則置于含5%~7%CO2的37℃溫箱孵育。2～6 h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀。加入5 ml 37℃預(yù)熱的*培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回孵箱孵育1～6天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá)，或者如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化則直接進(jìn)行步驟7。
（5）在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細(xì)胞或者吸去沉淀溶液后將細(xì)胞暴露于甘油與丁酸鈉中會促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA。
2、用氯喹處理細(xì)胞
氯喹是一種弱堿，推測是通過抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA而發(fā)揮作用（Luthman and Magnusson 1983）。細(xì)胞對氯喹毒性的敏感度限制了培養(yǎng)基中加入氯喹的濃度及時(shí)間，不同細(xì)胞所需氯喹*濃度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定。
（1）在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細(xì)胞前或后按1：1000將100 mmol/L氯喹直接加入培養(yǎng)基中。
（2）細(xì)胞于含5%~7%CO2的37℃溫箱中孵育3~5 h。
（3）在用DNA于氯喹孵育細(xì)胞后，移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加5 ml預(yù)熱的*培養(yǎng)基。細(xì)胞于孵箱中培養(yǎng)1～6天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá)，或者直接進(jìn)行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
3、丁酸鈉處理細(xì)胞
丁酸鈉的作用機(jī)制并不確定；但它是組蛋白乙酰化形成使外來質(zhì)粒DNA趨于轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（Workman and Kingston 1998）。
（1）甘油休克處理后，將500 mmol/L丁酸鈉直接加入生長培養(yǎng)基（甘油處理的步驟d）。細(xì)胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他細(xì)胞系所需濃度依經(jīng)驗(yàn)而定。