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細(xì)胞冷凍保存方法、注意事項(xiàng)
最近更新時(shí)間：2014-11-19
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1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 ％致密度。
2、冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micron FGLP flon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4 oC 避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲(chǔ)存后對細(xì)胞會(huì)有毒性。
4、冷凍保存之細(xì)胞濃度：
（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。
（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。
5、冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。
6、冷凍方法：
（1）傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(shí)(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 長期儲(chǔ)存。
（2）程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
7、材料：
（1）生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
（2）新鮮培養(yǎng)基
（3）DMSO (Sigma D-2650)
（4）無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
（6）血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片
（7）等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
8、步驟：
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。
（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
（5）冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16～18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲(chǔ)存。
（6）冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL