DC-CIK細(xì)胞的制備方法

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相關(guān)產(chǎn)品：

CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫(xiě)，中文全稱(chēng)為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞"。 CIK是單個(gè)核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群， 其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是目前臨床上廣泛使用的過(guò)繼性免疫治療細(xì)胞。

DC是“Dendritic Cells"的縮寫(xiě)，中文全稱(chēng)為“樹(shù)突狀細(xì)胞"，因其成熟時(shí)伸出許多樹(shù)突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能zui強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已證實(shí)，DC是*能夠顯著刺激初始T細(xì)胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它APC(如單核巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細(xì)胞。DC是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

DC-CIK即DC和CIK細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴(yán)格的說(shuō)，zui終的效應(yīng)細(xì)胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細(xì)胞毒活性也得以增強(qiáng)，因此DC-CIK較單獨(dú)的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負(fù)載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強(qiáng)，常被用于臨床和科研。

【培養(yǎng)原理】

1．DC培養(yǎng)用細(xì)胞因子：

nGM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)：

GM-CSF是一種造血生長(zhǎng)因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的集落形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF是zui早被鑒定出來(lái)對(duì)于DC有作用的細(xì)胞因子之一。

GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面MHC II類(lèi)分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進(jìn)DC的存活。

nIL-4 (白細(xì)胞介素-4)

IL-4在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC的過(guò)程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。同時(shí)，IL-4還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14分子的能力。CD14表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC的重要標(biāo)志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時(shí)的DC具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá)MHC I類(lèi)、II類(lèi)分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表達(dá)CD14。

nTNF-a (腫瘤壞死因子-a)

TNF-a可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHC II類(lèi)分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面MHC I類(lèi)、II類(lèi)分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時(shí)DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可*的激活T細(xì)胞。

2．CIK培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：

nCD3激發(fā)型單抗：

T細(xì)胞活化的*信號(hào)來(lái)自于T細(xì)胞表面的受體，即T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細(xì)胞表面，其與CD3分子通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，形成TCR/CD3復(fù)合體。TCR識(shí)別特異性抗原后會(huì)引起CD3和T細(xì)胞表面的輔助受體CD4或CD8分子的胞漿尾部聚集，進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進(jìn)一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP激酶途徑等)，zui終通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細(xì)胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，T細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。

由上可見(jiàn)，CD3分子在T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細(xì)胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使T細(xì)胞增殖和活化。也就是說(shuō)，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識(shí)別和激活過(guò)程，從而引起T細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK細(xì)胞培養(yǎng)中*的刺激因素。

此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號(hào)。研究表明，僅克隆號(hào)為OKT-3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK培養(yǎng)時(shí)，選用OKT-3克隆，以保證每個(gè)患者的T細(xì)胞均能被激活。

nIL-2 (白細(xì)胞介素-2)

IL-2zui初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細(xì)胞增殖zui重要的細(xì)胞因子。IL-2既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過(guò)與T細(xì)胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2還可刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK細(xì)胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與活化。

nIFN-g (干擾素-g)

IFN-g 具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用，因此會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過(guò)程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-g加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- g，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。

nIL-1a(白細(xì)胞介素-1a)

IL-1a也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1a與IFN-g和激發(fā)型CD3單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK 的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】

1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集

1.1用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞80 - 100ml；

1.2淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

1.3無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到 1-3 x 10⁸。

2．(可選步驟) 腫瘤抗原的制備

用于負(fù)載DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。

用TSA或TAA負(fù)載的DC具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類(lèi)少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無(wú)法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r(shí)無(wú)需知道那些抗原是腫瘤細(xì)胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同抗原決定簇的細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。

腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載DC的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC、用凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC，用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載DC，和將腫瘤細(xì)胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC，因該方法簡(jiǎn)單、快速、有效。

反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見(jiàn)方法，具體步驟如下：

2.1手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無(wú)菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

2.2無(wú)菌生理鹽水洗3次；

2.3用無(wú)菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，充分研磨；

2.4200目無(wú)菌網(wǎng)過(guò)濾后收集單細(xì)胞懸液；

2.5用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1-2 x 10⁷/ml，裝入5ml無(wú)菌凍存管中；

2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37℃水浴中解凍10 min。反復(fù)3-5次；

注：也可以-80℃/37℃反復(fù)凍融3-5次。

2.7將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；

2.8收取上清，0.22mm濾膜過(guò)濾除菌，留樣檢測(cè)蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體；

2.9-80oC保存?zhèn)溆谩?br>

3．CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

3.1步驟1中獲得的PBMC 用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 x 10⁶/ml，置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

3.237℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細(xì)胞貼壁;

3.3收集懸浮細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1-2 x 10⁶/ml；

3.4加入1 000 U/ml 的重組人IFN-g培養(yǎng)；

3.524h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；

注：此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml的重組人IL-1a。

3.6每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；

3.7在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK細(xì)胞，此時(shí)數(shù)量應(yīng)達(dá)到1x 10⁹個(gè)以上。

3.8CIK細(xì)胞質(zhì)控：

3.8.1臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

3.8.2用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表達(dá)，觀察CD3+CD56+細(xì)胞的比例是否明顯提高。

4．DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

4.1步驟3.2中剩下的貼壁細(xì)胞(主要是CD14+的單核細(xì)胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1 000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化；

4.2每3d 半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；

4.3(可選步驟) 在培養(yǎng)的第5d， 加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50 mg/ml，對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載；

注：若不對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。

4.4在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-a(500U/ml)，誘導(dǎo)DC 細(xì)胞成熟；

4.5在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC 細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×10⁶ 個(gè)以上；

4.6DC的質(zhì)檢：

4.6.1臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

4.6.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC 細(xì)胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表達(dá)，以確定DC是否成熟。

5. DC-CIK細(xì)胞的制備和質(zhì)檢

5.1收集步驟4和步驟3中所獲得的DC 細(xì)胞和CIK 細(xì)胞，按1∶10 (數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；

5.2每3天半量換液一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 (300U/ml)。

5.3在第7d 收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×10¹⁰個(gè)以上；

5.4DC-CIK細(xì)胞的質(zhì)檢：

5.4.1臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

5.4.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。

5.4.3細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以DC-CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 10⁴個(gè)，終體積為200 ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。

5.4.4收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【步驟簡(jiǎn)圖】 

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