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吖啶橙區(qū)分活細(xì)胞DNA和RNA的熒光組織化學(xué)染色法
最近更新時(shí)間：2015-1-30
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吖啶橙區(qū)分活細(xì)胞 DNA 和 RNA 的熒光組織化學(xué)染色法
吖啶橙《acridine oran。AO)屬于三環(huán)雜芳香類異嗜性陽(yáng)離子熒光染料，主要以兩種方式與核酸結(jié)合，一是嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間；二是與單鏈核酸的磷酸發(fā)生靜電相互作用。當(dāng)吖啶橙與DNA或RNA結(jié)合時(shí)，zui大發(fā)射波長(zhǎng)分別為525nm或650nm，產(chǎn)生綠色熒光或橙紅色熒光，因此，吖啶橙是研究核酸的一種常用熒光組織化學(xué) 染料。下面介紹應(yīng)用吖啶橙區(qū)分活細(xì)胞和原位組織細(xì)胞DNA和RNA熒光組織化學(xué)染色法。
1．溶液配制
(1)吖啶橙濃縮液(4℃、避光，可保存數(shù)月)
雙蒸水 50ml
吖啶橙 50mg
(2)甲液
雙蒸水 200ml
HCl 16ml
NaCl 1．74g
Triton X-100 0．2ml
(3)乙液
0．2mol／LNa2HP04／0．1mol／L枸櫞酸緩沖液(pH 6．0)
雙蒸水 100ml
Na2 HP04?12H20 4．51g
枸櫞酸(無(wú)水檸檬酸) 0．71g
溶解后，依次加入以下試劑和吖啶橙濃縮液
NaCl(0．15mol／L) 0．87g
EDTA-Na(1mmol／1) 0．037g
吖啶橙濃縮液 0．6ml
加入吖啶橙濃縮液后，應(yīng)盡早使用。
2．操作程序
(1)取0．2ml含10％小牛血清的細(xì)胞懸液，再與0．4ml冷“甲液"混合，振蕩15秒；
(2)加入l.2ml"乙液"，充分混勻；
(3)于10分鐘內(nèi)，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm。
結(jié)果：DNA為黃綠色熒光，而RNA為橘紅色熒光。如果同時(shí)進(jìn)行DNA和RNA染色時(shí)，需用鰲合劑處理，使雙鏈RNA變性，確保所有的RNA均為單鏈，而雙鏈DNA不受影響，增加結(jié)果的可信性。鰲合劑以乙二胺四乙酸(EDTA)為佳。