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士鋒生物植物基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)
最近更新時(shí)間：2015-3-12
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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通過大腸桿菌表達(dá)目的基因大量獲得重組蛋白是一個(gè)方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特異設(shè)計(jì)的質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)啟動子控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)。當(dāng)需要表達(dá)蛋白時(shí)，在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入IPTG來啟動表達(dá)。不同載體在鄰近克隆位點(diǎn)處具有編碼不同的多肽“標(biāo)簽"的序列，在定位、檢測或純化目的蛋白時(shí)提供方便。
以pET-32a(+)為例，介紹將目的基因克隆進(jìn)載體并進(jìn)行表達(dá)獲得重組蛋白的過程，從而熟悉根據(jù)自己的要求采用不同的載體進(jìn)行原核表達(dá)的全過程。
1.準(zhǔn)備工作（試劑配置和器材準(zhǔn)備）
1)操作流程示意圖
主要步驟操作
①制備pET-32a(+)載體 用限制性酶消化，去磷酸化后膠純化回收
②制備插入DNA PCR裝入質(zhì)粒后進(jìn)行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)載體 插入片段與pET連接，轉(zhuǎn)化
④轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 轉(zhuǎn)化帶有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印跡、定量分析確定目的蛋白
⑥放大試驗(yàn)純化目的蛋白 放大試驗(yàn)，制備粗提物，親和純化，切除融合標(biāo)簽
2)配制生長培養(yǎng)基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存儲液。
3)宿主菌的保存。長期存放菌株和pET重組子應(yīng)保存于甘油中。
4)感受態(tài)細(xì)胞的制備，參照其它試驗(yàn)手冊。
2.操作步驟
[1] 制備載體
1）載體消化和膠純化
3μg pET載體
3μl 10×限制性內(nèi)切酶buffer
10-20U 兩種酶（是否共用buffer; 酶體積不要超過反應(yīng)體系的10%）
3μl 1mg/ml乙酰BSA（根據(jù)需要
補(bǔ)足水到30μl
2)37℃溫浴2-4h
3)取3μl樣品進(jìn)行電泳檢測消化反應(yīng)進(jìn)行的程度
4)消化*后，加入0.05U小牛堿性磷酸酶，37℃ 30min
5)全部樣品在1%瓊脂糖膠上電泳，切帶按照膠回收試劑盒說明回收目標(biāo)片段。
6)-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>
[2]制備插入片段
限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因，克隆進(jìn)T－載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進(jìn)行消化和膠回收。但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。