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DIGE熒光差異凝膠電泳技術(shù)特點及應(yīng)用
最近更新時間：2015-7-2
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>28.7KB
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DIGE熒光差異蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ谕粔K膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并*次引入了內(nèi)標(biāo)的概念，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計學(xué)可信度達(dá)到95%以上。
熒光染料種類雖多，但用于蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記的熒光染料不同于普通熒光染料，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不應(yīng)該有等電點上的改變，分子量上的改變也應(yīng)該保持zui小而且不同熒光染料導(dǎo)致的分子量的改變應(yīng)該一致。用于蛋白質(zhì)預(yù)先標(biāo)記的熒光染料分為兩類，zui小標(biāo)記和飽和標(biāo)記。其中zui小標(biāo)記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團-NHS脂，可以特異性的標(biāo)記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點不會發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標(biāo)記會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基被熒光標(biāo)記修飾，才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標(biāo)記樣品時，保證合適的蛋白質(zhì)和染料的摩爾數(shù)比例至關(guān)重要。通過調(diào)整合適的pH值、合適的染料和蛋白質(zhì)的摩爾比，可以保證每個蛋白質(zhì)分子zui多只標(biāo)記上一個染料分子，來保證蛋白質(zhì)的分子量變化zui小。
 | 主要特點： 1. DIGE熒光差異分析，用于檢測蛋白表達(dá)中真實的生物學(xué)差異，并對差異進(jìn)行定量。 2. DIGE技術(shù)結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)和*的多重?zé)晒夥治黾夹g(shù)。 3. 不同的樣品分別由電荷和分子量匹配的DIGE熒光標(biāo)記物預(yù)標(biāo)記，隨后再混合并在同一塊膠上跑電泳。 4. 常規(guī)檢測到小于10%的蛋白表達(dá)差異而統(tǒng)計學(xué)可信度達(dá)到95%。 |
實驗流程
1. 為保證實驗順利進(jìn)行，須對樣本進(jìn)行預(yù)實驗，以檢測甲方提供的樣品是否合格。
2. 預(yù)實驗順利完成后，進(jìn)行正式實驗，電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品（其中包括一個蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)），將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品混合，在同一塊膠上進(jìn)行雙向電泳，電泳結(jié)果分別用3種不同的激發(fā)波長得到不同顏色的熒光信號，根據(jù)這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計學(xué)可信度達(dá)到95%以上。
3. 質(zhì)譜分析（包括膠內(nèi)酶切、串聯(lián)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索）
4、蛋白點的質(zhì)譜鑒定：質(zhì)譜的數(shù)據(jù)通過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索來確定蛋白點所對應(yīng)的基因
