會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://true-witness.com/st236594/
士鋒聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度
最近更新時(shí)間：2015-7-7
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>214.3KB
文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：250次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：939次
一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)"和“不連續(xù)系統(tǒng)"兩種電泳系統(tǒng)?！安贿B續(xù)系統(tǒng)"zui大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng)；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實(shí)驗(yàn)中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3。可見，凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同，形成了一個(gè)不連續(xù)系統(tǒng)。
電泳時(shí)，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴(kuò)散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合，以提高密度；為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動(dòng)的情況，樣品中還加入溴酚藍(lán)等示蹤染料，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動(dòng)的速度都快，只要染料未泳動(dòng)出凝膠管，樣品就沒有走出膠管的危險(xiǎn)。
在不連續(xù)系統(tǒng)中，當(dāng)接通電源開始電泳時(shí)，系統(tǒng)中的甘氨酸、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子，形成離子流向陽極泳動(dòng)。其遷移率取決于離子的電荷數(shù)、分子量大小及形狀。然而，當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時(shí)，它們遇到了比pH8.3低的pH(6.7)，pH下降了近兩個(gè)單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢。血清樣品中個(gè)蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠，pH的改變雖對(duì)其解離度有影響，但比對(duì)甘氨酸要小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對(duì)蛋白質(zhì)分子不會(huì)造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離，分子量很小，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍(lán)<Cl-的順序。
甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降，造成移動(dòng)離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減小電導(dǎo)率下降。然而，整個(gè)電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度，I為電流強(qiáng)度，n為電導(dǎo)率）的關(guān)系，于是在前導(dǎo)離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個(gè)局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導(dǎo)Cl-離子區(qū)域。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl-區(qū)域時(shí)因不缺少離子，大的電場強(qiáng)度減弱，離子移動(dòng)速度急速減慢下來，其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個(gè)過程，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。
當(dāng)離子流繼續(xù)向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí)，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時(shí)在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場強(qiáng)度，蛋白質(zhì)的分離*按一般區(qū)帶點(diǎn)用方式進(jìn)行。
由以上的原理可見，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳zui主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時(shí)，成分間由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來的干擾，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個(gè)區(qū)帶。
（二）試劑和器材
1．測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。
2．試劑
（1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑
① 凝膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶，4℃貯存。
② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲(chǔ)液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存，一般可放置1個(gè)月左右。
③ 分析純過硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃儲(chǔ)存僅能用一周，當(dāng)天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。
④ 濃縮膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液：稱Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過濾后置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，置棕色試劑瓶內(nèi)，4℃貯存。
（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調(diào)pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。
（3）0．1%溴酚藍(lán)指示劑
（4）染色液 染色液種類較多，染色方法也不*相同。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，含20%磺基水楊酸，其優(yōu)點(diǎn)是染色、固定同時(shí)進(jìn)行，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍(lán)R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍(lán)0.05g，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml，過濾后置試劑瓶內(nèi)保存。
（5）脫色液 7%乙酸溶液
（6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml。
（7）1%瓊脂（糖）溶液 瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解，4℃貯存，備用。
3．器材 電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。