會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://true-witness.com/st236594/
士鋒蛋白質(zhì)的提取及粗分離
最近更新時(shí)間：2015-7-15
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：252次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：843次
基本原理
分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，zui后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。
TNF的提取是將發(fā)酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出來，經(jīng)離心收集混合液中提取的TNF成份的過程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的雜蛋白，由于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度主要取決于蛋白質(zhì)分子表面的水分子數(shù)目，即蛋白質(zhì)表面親水基團(tuán)與水分子形成水化膜的程度和帶電荷的情況，當(dāng)中性鹽如硫酸銨等加入蛋白質(zhì)溶液時(shí)，由于中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱或消失，蛋白質(zhì)溶解度降低，同時(shí)由于中性鹽的加入，蛋白質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間互相聚集而發(fā)生沉淀。不同的蛋白質(zhì)由于其帶電性，親水性等性質(zhì)的不同，會(huì)在不同濃度的鹽中形成沉淀。依此原理可對(duì)混合蛋白質(zhì)進(jìn)行粗分離。該實(shí)驗(yàn)中利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白從而使TNF得到初步純化。
試劑配制
一、STE（25%蔗糖 10mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1mmol/L EDTA）
1．取 蔗糖 250g
1mol/L Tris.HCl 10ml
0.5mol/L EDTA 2ml,加水至1000ml
115℃，20min高壓滅菌
2．1mol/L MgCl2
取 MgCl2 203.30g，加水至1000ml
3．Tris-HCl pH8.5
取Tris 121.14g
用HCL調(diào)pH至8.5，加水至1000ml
（12mol/L HCl 約30ml）
4．0．5mol/L EDTA pH8.5
取 乙二氨四乙酸二鈉 186.12g
NaOH 20g，加水至1000ml
121℃，20min高壓滅菌
操作步驟
1．稱取菌體重量，按5~10ml/g菌體加入STE溶液，攪拌至菌體*懸浮。
2．按0.5~1mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力攪勻后于4℃環(huán)境中放置20min。此時(shí)菌液呈粘稠狀。
3．按10mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的脫氧膽酸鈉（DOC）溶液，用力攪勻。
4．加入5~10ml 1mol/L MgCl2溶液，攪勻后加入約40μl Dnase I（25mg/ml）充分?jǐn)嚢柚辆鹤兿 ?/em>
5．15000rpm，4℃離心30min。
6． 取離心上清，量取其體積，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，倒入置于冰浴的燒杯中，邊攪拌邊緩慢加入固體硫酸銨使其達(dá)到50%飽和度。待固體硫酸銨安全溶解后，靜置于0℃環(huán)境中30min。
7．離心，15000rpm，4℃，30min。取離心上清，量其體積，測(cè)定蛋白濃度。
8．將離心上清裝入透析袋，4℃攪拌在pH8.5 20mmol/L Tris-HCl ,1mmol/L EDTA溶液中透析。
加入硫酸銨不論是固體硫酸銨，還是加入飽和硫酸銨溶液，加入時(shí)應(yīng)邊加入邊攪拌，特別注意① 加入硫酸銨要慢，因?yàn)樘鞎?huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生共沉淀，加入固體硫酸銨時(shí)事先要將硫酸銨研磨成粉末，加入飽和硫酸銨溶液時(shí)要一滴一滴地加入；② 攪拌要慢，攪拌劇烈，蛋白質(zhì)溶液容易起泡沫，由于表面張力效應(yīng)會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。