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聚合酶鏈式反應（PCR）擴增與擴增產物克隆
最近更新時間：2015-8-5
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概 述
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(DeNature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍（圖4）,這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經25-35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106 倍。
一、 pcr反應中的主要成份
1. 引物：PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應隨機分布，在3’端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導致錯誤引發(fā)。(4) 引物3’端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。(5) 在引物內, 尤其在3’端應不存在二級結構。(6) 兩引物之間尤其在3’端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 (7) 引物5’端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應在5’端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。(8) 引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩(wěn)定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。 (9) 簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3’端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。
一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體, 過低則降低產量。利用紫外分光光度計, 可計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數。
2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應用NaOH 將pH調至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應中合成2.6μg的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq dna聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。
3. Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR反應,可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,選出zui適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證zui適Mg2+ 濃度。
4. 模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數量和純度.一般反應中的模板數量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1μg的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少.靈敏的PCR可從一個細胞,一根頭發(fā),一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產物.DNA中的雜質也會影響PCR的效率。
5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.現在人們又發(fā)現許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間.Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意.在100μl PCR反應中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán).所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減.酶量過多會使產物非特異性增加,過少則使產量降低.反應結束后,如果需要利用這些產物進行下一步實驗,需要預先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。
6. 反應緩沖液：反應緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ . Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,但在實際PCR反應中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利.各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。