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RNA點雜交實驗步驟
最近更新時間：2015-8-20
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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1） 純化的RNA的點雜交和狹線雜交
安裝印跡裝置
1．切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標上表示方向的記號。用水把膜簡單弄濕，在20×SSC中室溫泡1 h。
2．在膜浸泡期間，先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印跡裝置，再用無菌水洗干凈。
3．把兩片厚濾紙用20×SSC浸濕，再放到真空器頂部。
4．把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動以去除膜與裝置夾層中的氣泡。
5．加緊夾板，連接真空管。
6．加入10×SSC直至液面沒過尼龍膜，關(guān)掉真空，再用10×SSC充滿。
RNA樣品準備
1．把每個RNA樣品（溶解在10μl水）分別與30μl RNA變性液混合。
2．65℃溫育5 min，然后在冰上冷卻。
3．向每個樣品中加入等體積20×SSC。
4．輕輕向印跡裝置中吸入10×SSC，直到淹沒尼龍膜。
RNA樣品的印跡和RNA在膜上的固定
1．把所有樣品輕輕加入狹線中，然后輕輕吸干膜。當所有樣品都鋪到膜上后，每個狹線用1 ml 10×SSC洗兩次。
2．當?shù)诙蜗茨ね瓿珊?，繼續(xù)輕輕吸干膜。
3．取下膜，用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。
固定化RNA的雜交與洗膜
1．把膜放入烤盤或雜交爐中，加入10~20 ml預雜交液68℃溫育2 h。
2．把已變性的放射性標記的探針直接加到預雜交液中。在適當?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育12～16 h。
3．雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉(zhuǎn)移到室溫下裝有100～200 ml、1×SSC（0.1% SDS）的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖10 min。
4．把膜轉(zhuǎn)移到另一個裝有100～200 ml、預熱到68℃的0.5×SSC（含0.1% SDS）的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖10 min。
5．按步驟17重復洗膜兩次，使總的洗膜次數(shù)達到三次。
6．用濾紙吸干膜，在-70℃條件下放射自顯影24～48 h（Kodak XAR-5 或相當?shù)哪z片）。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當然，磷光成像儀也可以用來成像。
2）RNA斑點印跡的制備（詳見《分子醫(yī)學技術(shù)》106頁）
1．裁一張大小合適的濾膜，用軟鉛筆標記RNA加樣的位置，一個cm的方格即可。
2．以20×SSC浸泡濾膜。
3．在65℃用以下溶液溫育5min，使10～20μg的總RNA變性。
總RNA（10～20μg）
2.0μl
變性液
6.0μl
置冰浴快速冷卻5min，用微量離心管離心片刻以回收液滴，將管置于冰浴。
4．將濾膜鋪在一疊經(jīng)20×SSC浸泡過的濾紙（如Whatman 3MM）上。
5．在膜上點樣，每孔4μl RNA，待一孔干燥后再加另一孔。
6．將濾膜置濾紙（3MM）上稍微晾干，用20×SSC漂洗片刻。
7．當濾膜仍潮濕時，將濾膜RNA面朝下在紫外線透照儀照射3～5min，使RNA固定于濾膜上，此濾膜已可用于雜交。