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士鋒隨機(jī)引物PCR技術(shù)
最近更新時間:2015-9-9
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一.實(shí)驗(yàn)原理
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction)簡稱PCR,它是一種DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1985年美國的Mullis等人發(fā)明了PCR技術(shù),在體外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶,通過DNA變性、復(fù)性和延伸過程合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。反復(fù)重復(fù)這一過程,模板DNA就可得到大量擴(kuò)增。在PCR過程中,DNA的延伸起初是用大腸桿菌的DNA聚合酶I(Klenow片段)來完成的。由于大腸桿菌的聚合酶不耐熱,每次加熱變性DNA后都要補(bǔ)加新的聚合酶。這不僅增加了實(shí)驗(yàn)成本,而且當(dāng)同時擴(kuò)增多個樣品時極易出錯。在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)發(fā)現(xiàn)后,才使PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用成為可能。特別是自動熱循環(huán)儀(又叫DNA擴(kuò)增儀)的發(fā)明,使PCR反應(yīng)過程可以電腦控制,實(shí)現(xiàn)了自動化。PCR技術(shù)的發(fā)明雖然只有10多年的時間,但目前這一技術(shù)及其衍生的其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)在生物學(xué)的許多領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。
隨機(jī)引物PCR(Arbitrary - primer PCR,縮寫為AP-PCR)又稱隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polimophic DNA,縮寫為RAPD),是Williams和Welsh等1990年在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在RAPD擴(kuò)增中,僅用一個8-10堿基的寡核苷酸引物,引物的序列是隨機(jī)的。RAPD反應(yīng)的條件與普通PCR基本相同。但由于引物較短,一般退火所需溫度較低。RAPD與普通PCR的另一個明顯的不同是前者不需知道模板DNA的序列,擴(kuò)增出來的片段也是非特異性的;而后者則必須知道待擴(kuò)增目的片段的序列,根據(jù)這一序列設(shè)計一對相應(yīng)的引物。
RAPD技術(shù)一出現(xiàn),便以它的簡便、快捷和多態(tài)性撿出率高而引起科學(xué)工作者的極大興趣。目前這一技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、DNA指紋分析和基因定位等不同研究領(lǐng)域。
二.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)在0.5ml無菌離心管中依次加入下列溶液(在超凈臺上操作),加入后輕輕混勻。
無菌水 13μl
10×擴(kuò)增緩沖液 2.5μl
4dNTPs溶液 1.5μl
引物 2.5μl
植物DNA(5ng/μl) 5μl
--------------------------- Taq DNA聚合酶 0.5μl
總體積 25μl
(2)加入100μl礦物油,遮蓋反應(yīng)混合液的表面。
(3)將試管轉(zhuǎn)入DNA擴(kuò)增儀,按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)(需預(yù)先調(diào)節(jié)),共進(jìn)行45個循環(huán):
變性 復(fù)性 聚合反應(yīng)
94°C ,1分 35°C,1分 72°C,2分
(4)循環(huán)完成后,在72°C再延伸6分鐘。
(5)將反應(yīng)產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察擴(kuò)增的DNA條帶。