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實(shí)時(shí)熒光定量PCR:一種科學(xué)準(zhǔn)確的定量方法
最近更新時(shí)間：2015-9-23
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實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
一. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理
所謂實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
1.在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:一種科學(xué)準(zhǔn)確的定量方法
圖1. Ct值的確定
2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定
pcr反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關(guān)系
研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。