植物RAPD分析技術(shù)

最近更新時(shí)間：2015-10-21

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RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA），意為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，是利用PCR技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，把擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNA條帶的多態(tài)性來(lái)反應(yīng)模板DNA序列上的多態(tài)性。RAPD同AFLP、SSR等分子標(biāo)記一樣都基于PCR擴(kuò)增，只是RAPD分析只需要一個(gè)引物，其引物長(zhǎng)度一般為10個(gè)核甘酸，其序列是隨機(jī)的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售。
單引物擴(kuò)增是通過(guò)一個(gè)引物在兩條DNA互補(bǔ)鏈上的隨機(jī)配對(duì)來(lái)完成。由于基因組DNA的差異，使引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)及這些位點(diǎn)之間的距離不同，使PCR擴(kuò)增后的片段大小表現(xiàn)出多態(tài)性。在基因組DNA分子內(nèi)可能存在或長(zhǎng)或短被間隔開的顛倒重復(fù)序列，如果這些序列與引物能堿基配對(duì)，則在兩條單鏈上就會(huì)出現(xiàn)該引物的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量取決于這種重復(fù)序列的多少。不同DNA分子中這種顛倒重復(fù)序列間隔的長(zhǎng)短不同，擴(kuò)增條帶的大小就不同，即表現(xiàn)出多態(tài)性。
10堿基引物理論上有410 種組合，不同引物檢測(cè)的模板序列不同，用足夠多的引物可覆蓋基因組全序列，檢測(cè)位點(diǎn)多，可以在*不知道分子生物學(xué)背景的情況下對(duì)基因組進(jìn)行分析，是研究植物系譜關(guān)系、起源與進(jìn)化、遺傳多樣性及分子標(biāo)記輔助育種的簡(jiǎn)單易行的方法；此外，外源基因轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株相比，外源基因插入的部位導(dǎo)致基因組DNA序列不同或重排，當(dāng)引物適宜時(shí)，擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)短就會(huì)不同，RAPD技術(shù)可以檢測(cè)出對(duì)照植株和轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR產(chǎn)物帶型的區(qū)別。
由于隨機(jī)引物短，與模板結(jié)合的退火溫度低，易出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，因此在實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格操作程序及條件，使RAPD分析的結(jié)果較為穩(wěn)定。因其費(fèi)用較低，方便易行，模板DNA用量少，不需要同位素，安全性好，繼RFLP之后得到廣泛應(yīng)用；且操作上比AFLP、SSR等分子標(biāo)記較為簡(jiǎn)便易行，因此，多數(shù)種類的栽培植物在資源多樣性、分子標(biāo)記等方面都有大量RAPD的研究報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)RAPD技術(shù)的原理，掌握RAPD的操作及分析方法。
一、試材及用具
試材:植物基因組DNA。
用具:PCR儀，1μL、10μL、20μL、100μL微量移液器及吸管，PCR管（200μL或500μL）及管架，1.5 mL離心管及管架，離心機(jī)，記號(hào)筆，磁力攪拌器，高壓滅菌鍋，電泳儀，電泳槽，電爐，三角瓶，紫外透射儀、凝膠成像系統(tǒng)。
藥品:10核苷隨機(jī)引物、dNTP、瓊脂糖、耐熱DNA聚合酶［TagDNA聚合酶，與酶一起的還有兩種藥品，分別是10× PCR Buffer（500 mmol/LKCL、pH 9.0的100 mmol/L Tris-Cl、1.0%Tritonx?100）和25 mmol/L MgCl2。
其他的藥品和緩沖液有:
10 mg/mL的溴化乙錠（EB）貯存液:在100 mL蒸餾水中加入1g EB，在磁力攪拌器上攪拌數(shù)h，使其*溶解，轉(zhuǎn)至棕色瓶中避光4 ℃保存。EB是強(qiáng)誘變劑，稱量時(shí)要戴手套和口罩。一旦接觸了EB，立即用大量水沖洗。
1× TAE電泳緩沖液:50× TAE濃縮貯存液含Tris堿242g；冰醋酸57.1 mL；pH 8.0的0.5 moL/L EDTA 100 mL；加600 mL蒸餾水，在磁力攪拌器上攪拌，zui后加蒸餾水定容至1000 mL。
6× 凝膠加樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。
二、方法步驟
（一） 高壓滅菌
把所用的吸頭、PCR管、離心管等用具在高壓滅菌鍋中121℃（約1.1 kg/cm2 ）高壓滅菌30 min。
（二）PCR反應(yīng)物的混合
所用反應(yīng)體系為:25μL反應(yīng)體系中，10× PCR Buffer2.5 μL，2.0 mmol/L MgCl2 ，0.2 mmol/L dNTP,，各引物0.1 μmol/L，TaqDNA酶1.5 U，各品種DNA模板濃度為20~50 ng，加重蒸水（dd H2O）補(bǔ)充到25 μL。
按照該反應(yīng)體系，先在1.5 mL離心管中冰浴混合除模板以外的各成分，充分混勻，稍離心，分裝到各PCR管中，然后把各品種的DNA模板分別加入到各管中，蓋嚴(yán)管蓋，在管外壁上做好標(biāo)記，稍離心，放入PCR儀中。
（三）PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)在DNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行，所用程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，36℃退火30 s，72℃2 min，44個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后, 取出管子，置4℃冰箱中保存。
注意問(wèn)題。在進(jìn)行大量擴(kuò)增前需對(duì)該物種確定擴(kuò)增的優(yōu)化體系，尤其是沒有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的植物種類，如Mg2+ 適宜的濃度，TaqDNA酶的用量，退火溫度等，各因子設(shè)計(jì)出梯度，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增帶的穩(wěn)定性和亮度來(lái)確定優(yōu)化的反應(yīng)體系。
（四）瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物
制膠。根據(jù)PCR反應(yīng)管的數(shù)量和電泳槽的大小估算瓊脂糖膠的體積，稱1.6~2.0 %的瓊脂糖溶解于1×TAE電泳緩沖液中，在電爐上加熱使瓊脂糖充分溶解，待溶液溫度降到60℃，加入EB，使EB的終濃度為1 μg/mL，搖勻，倒入帶有梳子的膠床中，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下約30 min膠自然凝固。
點(diǎn)樣。取出擴(kuò)增DNA的管子，取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL加樣緩沖液混合；輕輕拔出瓊脂糖膠上的梳子，把瓊脂糖膠放入電泳槽中，倒入1× TAE電泳緩沖液使液面高出膠面約1 cm；移液器插上10 μL吸管吸入DNA樣品后，插入加樣孔底部，緩慢把DNA樣品加入到點(diǎn)樣孔中。
電泳。加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源，黑線連陰極，紅線連陽(yáng)極，打開電源，正確設(shè)定電壓及時(shí)間，時(shí)間的選擇取決于膠的長(zhǎng)度和電壓大小。一般用不高于5v/cm的電壓，電泳約2 h，待溴酚藍(lán)離膠邊約1~1.5 cm時(shí)停止電泳。
檢測(cè)和照相。小心取出凝膠，置于紫外透射儀上，紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增片段的有無(wú)及分離情況，在凝膠成像儀上照相，圖片保存于計(jì)算機(jī)中，待統(tǒng)計(jì)分析。
注意問(wèn)題。兩電極間電壓不應(yīng)超過(guò)5v/cm，電壓越高，遷移越快，但分離效果相對(duì)較差；擴(kuò)增帶如果不是細(xì)亮清晰而呈形狀模糊或條帶粗亮相連，可能是DNA加樣量太多或電壓過(guò)高或瓊脂糖濃度偏低等，在重新電泳時(shí)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
（五）RAPD條帶分析
把RAPD每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。以兩次重復(fù)中穩(wěn)定出現(xiàn)的亮帶作為統(tǒng)計(jì)對(duì)象，有電泳帶記為1，無(wú)電泳帶記為0，錄入計(jì)算機(jī)Excel表格中。利用STATISTIC軟件，采用UPGMA方法（非加權(quán)類平均法:Unweighted Pair Group Method using Arithmetric Averages）對(duì)所用品種或材料進(jìn)行聚類分析。S為兩樣品間的遺傳相似度，D為遺傳距離，S=2Nxy/(Nx+Ny)，D=1-S，Nxy為本兩個(gè)樣品共享的RAPD標(biāo)記數(shù)，Nx、Ny分別為X樣品和Y樣品分別具有的RAPD標(biāo)記數(shù)。
注意問(wèn)題。對(duì)電泳結(jié)果的判讀同PCR條件是否優(yōu)化及引物數(shù)量是否足夠等一樣，會(huì)影響RAPD 結(jié)果的可信度。對(duì)電泳結(jié)果的判讀主要是一些弱帶的取舍問(wèn)題，弱帶取舍主要看其重復(fù)出現(xiàn)的幾率，可進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)；也可在難取舍的弱帶位置上出現(xiàn)的電泳條帶都不統(tǒng)計(jì)，這樣可能丟失了一些多態(tài)性信息位點(diǎn)，對(duì)研究材料的系譜關(guān)系等影響不大，但當(dāng)研究分子標(biāo)記或構(gòu)建基因連鎖圖譜時(shí)就不可取。

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